真核表达载体pcDNA3.1—Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响

来源:用户上传      作者: 何珏　张文书　王珍玲

　　【摘要】 目的：构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后，外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达，并观察其对HEC细胞增殖的影响。方法：通过RT-PCR和T/A克隆等方法，构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中，通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC中表达的情况，并设立实验组（转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体）、空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、空白脂质体对照组，用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况，MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等，研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。结果：经限制性内切酶鉴定及测序，证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确，将其转染HEC细胞，转染后的HEC细胞在体外能继续增殖，但增殖能力明显下降。结论：Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功，并能在HEC细胞中表达，转染HEC细胞体外增殖能力明显降低，Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。
　　【关键词】 Beclin1； 真核表达载体； 细胞； 增殖
　　子宫内膜癌（EC）是仅次于乳腺癌和宫颈癌的常见女性生殖系统恶性肿瘤，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%[1]。其发病率每年10万人约有24.6人，在我国近二十年来也呈逐年上升趋势，但其发生、发展机理仍不十分明确。多数学者认为其发生发展与雌激素水平密切相关[2]。长期无拮抗的雌激素刺激可能是主要发病因素，在实验动物中可观察到雌激素引起子宫内膜有丝分裂增多的现象。
　　Beclin1是一种与自噬相关的抑癌基因，位于人染色体17q21上，在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌中该部位均存在缺失。有研究提示Beclin1的表达缺失导致自噬活性的减弱从而促进肿瘤的发生，故Beclin1在雌激素依赖性肿瘤子宫内膜癌的发生发展中起着重要的作用。因此，本研究旨在构建Beclin1真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，建立稳定表达Beclin1的细胞株，探讨Beclin1在子宫内膜癌细胞增殖中的影响，以期对子宫内膜癌基因治疗提供科学的依据，对内膜癌的发生发展关系的研究能进一步深入奠定实验基础。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料 高效真核表达载体pcDNA3.1质粒购自Oligoengine公司；G418和Lipofectamine2000购自Invivogen公司；BglⅡ、EcoRI、Hind Ⅲ、T4DNA链接酶、TaqDNA聚合酶和DL2000DNA分子量标记购自北京天根生物有限公司；琼脂凝胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、RNA抽提及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自Fermentas公司，兔抗人Beclin1多克隆抗体购自大连宝生物公司，所有DNA序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；人子宫内膜癌细胞HEC-1-B购自中国医学科学院上海细胞库，实验涉及各种酶类为NEB产品，嘌呤霉素为sigma产品，胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物制品公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 引物设计和子宫内膜细胞Beclin1基因扩增 在NCBI数据库中查找Beclin1的mRNA全序列，基因编号NM003766；根据其cDNA全长序列，参照国际流行标准，利用Invivogen公司的在线软件进行设计，选取编码区两侧的碱基合成相应的引物。上游引物序列（上游）5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATACAGT-3′，（下游）5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGT-3′，分别含有EcoRI、Hind Ⅲ酶切点位，目的片段为326 bp。按T/A克隆操作规范，参照Trizol试剂盒说明书提取人子宫内膜癌细胞株HEC总RNA，利用蛋白核酸分析仪测定RNA纯度及浓度，通过1%琼脂糖电泳鉴定RNA完整性；取300 ng总RNA，根据RT-PCR试剂盒说明进行逆转录合成Beclin1DNA；PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min、55 ℃退火1.5 min、72 ℃延伸0.5 min，共30个循环，最后72 ℃再延伸6 min终止。取PCR最终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，切取326 bp目的片段凝胶，利用试剂盒回收纯化目的片段。
　　1.2.2 构建Beclin1表达质粒 经EcoRI、HindⅢ双酶切后，再将插入片段定向插入真核载体pcDNA3.1的相应位点；连接产物转化DH5α感受态细胞，挑选单菌落，利用T/A法重组克隆提取质粒，用EcoRI、Hind Ⅲ双切酶鉴定，阳性克隆命名为pcDNA3.1-Beclin1。为检测目的基因是否正确插入载体以及有无基因突变的产生，阳性克隆送上海生物有限公司测序，将测序结果通过blast比对，完全正确的质粒命名为pcDNA3.1-Beclin1.
　　1.2.3 质粒转染HEC细胞 设立实验组（转染pcDNA3.1-Beclin1）、空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、空白对照组（脂质体组），体外传代培养HEC细胞，采用含10%小牛血清的DMEM培养基，将细胞稀释为3×105/mL接种于6孔板，细胞密度到70%时，利用脂质介导法转染pcDNA3.1-Beclin1重组质粒；转染后5 h换完全培养基继续培养24 h。Western blot法测定HEC中Beclin1的含量，按试剂盒说明书操作，利用图像分析系统对相应分子量目的条带进行定性分析。
　　1.2.4 MTT法检测转染细胞活性 在转染后24、48和72 h每孔加入MTT溶液（5 mg.rnL-1用PBS配制，pH=7.4）20 μL，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪490 nm波长处，测量各孔的吸光值，重复6次，记录结果，绘制细胞生长曲线。 　　1.3 统计学处理 用统计学软件SPSS 13.0对数据进行统计学分析，Western blot法测量结果采用重复测量方差分析（ANOVA）；计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 Beclin1基因扩增 T/A克隆PCR扩增，从人子宫内膜癌HEC细胞提取，经鉴定其纯度和完整性均较好，PCR扩增产物电泳得到约326 bp的特异条带，与预期扩增片段大小相符，见图1。
　　2.2 重组载体鉴定结果 将构建的pcDNA3.1-Beclin1重组质粒进行测序鉴定，测序结果与设计一致，见图2。
　　2.3 转染HEC细胞中pcDNA3.1-Beclin1表达测定 分别提取转染组、空载体组及对照组HEC细胞总蛋白，Western blot检测发现转染组条带明显增粗，提示有外源的Beclin1高表达，见图3。用荧光显微镜观察，发现在转染数小时后即可见到部分细胞表达Beclin1，在4 h之内表达Beclin1的HEC细胞数量逐渐增多，在48 h达到高峰，其pcDNA3.1-Beclin1转染细胞内出现大量明亮的绿色荧光，阴性对照组（空载体组）荧光表达百分率约为4.8%，转染组荧光表达百分率约为72.0%，瞬时转染效率70.0%，可以满足实验需要，见图4。
　　2.4 MTT检测转染HEC细胞增殖状态 MTT结果显示，pcDNA3.1-Belin1转染组与阴性对照组（脂质体组）及pcDNA3.1空载体组间HEB细胞相比吸光度值差异均有统计学意义（P<0.05）；阴性对照组织（脂质体组）与空载体对照组HEC细胞相比，吸光度值差异无统计学意义（P>0.05），见表1。描绘细胞曲线显示转染pcDNA3.1-Beclin1载体的子宫内膜癌HEC细胞生长有明显抑制，实验组织HEC细胞增殖明显低于对照组。
　　3 讨论
　　Beclin1位于人类染色体17q21上，大约有150 kb，最初是由学者在致死性Sindbis病毒性脑炎的研究中被发现的，被认为是一种双等位抑癌基因（hapliinsufficient tumor suppressor），其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一[3]。据研究，自噬基因通过自噬作用、抑制基因空突变、促进细胞凋亡、抑制血管构建而抑制肿瘤的发生。据报道75%的人类卵巢癌、50%乳腺癌和40%的前列腺癌细胞存在Beclin1单等位基因缺失突变，其表达量不同程度下降[4-6]。王赞宏等[7]通过研究发现，自噬基因Beclin1抑制人宫颈癌HeLa细胞的生长，降低其致瘤活性，抑制肿瘤细胞的恶性增殖，诱导自噬和凋亡，抑制肿瘤的生长。
　　子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，发病率呈明显上升和年轻化趋势。有关子宫内膜癌的发病机制仍不完全清楚，目前认为多基因、多阶段的癌基因或抑癌基因突变构成其发生和发展的分子基础。针对子宫内膜癌的Beclin1基因研究目前较为少见，浙江医科大学附属妇产科医院赵剑虹等[8]通过免疫组化的研究方法发现，Beclin1蛋白在正常子宫内膜组织、良性增殖的子宫内膜、子宫内膜癌组织中表达率逐渐下降且呈显著差异性，Beclin1蛋白表达程度与子宫内膜癌细胞分化、组织学类型相关，而与手术病理分期和肌层浸润深度无关。本课题组通过免疫组化实验证实：Beclin1蛋白在正常子宫内膜组织、良性增殖的子宫内膜、子宫内膜癌组织中表达率下降，呈显著差异性，与赵剑虹等[8]实验结果相一致。为更好的研究Beclin1蛋白表达程度只与子宫内膜癌发生发展的关系，笔者设计研究方案，用RT-PCR、T/A成功克隆扩增出Beclin1基因，成功构建了Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1，MTT法检测结果显示，转染外源性Beclin1基因后，实验组HEC细胞生长速率较其他两组明显减慢。Western blot法测定HEC中Beclin1的含量，在酶联免疫检测仪测量并纪录结果、绘制细胞生长曲线显示，当自噬基因Beclin1表达水平升高后，凋亡的细胞明显上升；提示Beclin1基因可通过自噬调控，进而影响子宫内膜癌的发生发展及临床预后，以Bcelin1基因为治疗靶点，可为子宫内膜癌的治疗提供广阔的视角。
　　综上所述，结合本研究，Beclin1的表达程度与许多肿瘤的发生发展过程相关[9]。因此，根据肿瘤发生的不同时期，调节Beclin1的表达，对于制定肿瘤的预防和治疗方案极为重要，在子宫内膜癌的治疗中，基于Beclin1的靶向治疗可成为一种新的探讨方向，全面阐明Beclin1的功能、机制及其调控网络，必将有助于理解子宫内膜癌的发生、发展规律，并有效指导子宫内膜癌的临床诊治。
　　参考文献
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　　[3] Yue Z，Jin S，Yang C，et al. Beclin1， an autophagy gene essential for early embryonic development， is a haplo-insufficient tumor suppressor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences， 2003， 100（25）： 5077-5082.
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　　[7]王赞宏，李莉，彭芝兰，等.自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究[J].中华肿瘤学杂志，2011，33（11）：804-809.
　　[8]赵剑虹，万小云，谢幸，等.Beclin1、PTEN在子宫内膜癌组织中的表达[J].癌症杂志，2006，25（6）：753-757.
　　[9]王霞，郭娜，弥曼，等.Beclinl与肿瘤研究进展[J].现代肿瘤学杂志，2013，21（5）：1149-1151.
　　（收稿日期：2014-01-26） （本文编辑：黄新珍）
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