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自噬基因Beclin1在喉鳞癌患者中的表达及临床意义

来源:用户上传      作者: 董蜀斌 王斌全

  【摘要】 目的:探讨自噬基因Beclin1在喉鳞癌组织中的表达及其临床意义。方法:应用免疫组织化学SP法检测77例喉鳞癌组织和22例正常组织中Beclin1的表达,分析Beclin1的表达与喉鳞癌生物学行为的关系。结果:Beclin1表达主要位于细胞浆,与正常组织比较,喉鳞癌组织中Beclin1的蛋白表达阳性率明显降低(P<0.05);Beclin1表达与喉癌的临床分型无关(P>0.05),与喉癌的T分期、分化程度及淋巴结转移相关(P<0.05)。结论:Beclin1表达缺失可能是喉鳞癌形成过程中的重要机制之一,可能成为探讨肿瘤发生和抑制肿瘤浸润转移研究的新靶点。
  【关键词】 喉鳞癌; Beclin1; 免疫组织化学
  喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤之一,严重威胁着患者的健康,其组织来源于喉黏膜上皮组织,最常见的喉癌为喉鳞状细胞癌[1-2]。自噬可以清除损伤组织,减少氧化应激的发生,从而维持细胞内环境稳定,降低突变率,抑制肿瘤的形成,而自噬的缺陷与肿瘤的发生关系密切[3]。Beclin1基因位于人染色体17q21,是第一个被发现的哺乳动物的自噬基因,在多种肿瘤中表现为表达降低和缺失,Beclin1表达缺失明显增加肝癌、肺癌和淋巴瘤的发生率,但自噬基因Beclin1的表达与喉癌的关系尚不清楚[4]。本研究通过检测喉鳞癌患者组织中自噬基因Beclin1的表达,探讨自噬基因Beclin1与喉鳞癌发生发展的关系。
  1 材料与方法
  1.1 组织标本来源 喉鳞癌标本由山西省肿瘤医院提供,共收集2005年1月-2007年12月行手术切除和病理确诊的77例喉鳞癌患者组织。其中男71例,女6例。年龄41~79岁,平均59.3岁。40例声门上型患者,30例声门型,6例声门下型,1例临床分型不确定。病理分类:5例高分化鳞癌,64例中分化鳞癌,8例低分化鳞癌。4例T1期患者,26例T2期患者,31例T3期患者,11例T4期患者,5例T分期不确定。15例有淋巴结转移,62例患者无淋巴结转移,纳入患者确诊时均无远处转移。所有患者手术前未经化疗和放疗,经病理检查均确认为鳞状细胞癌。手术切除的标本用10%甲醛固定,石蜡包埋,组织切片厚度4 μm 3张,对各1张组织切片进行HE、免疫组织化学染色、1张备用。另外选取22例正常喉组织,其中男20例,女2例,年龄44~75岁,平均58.5岁。两种组织标本一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
  1.2 主要试剂 Beclin1和p-PKB为多克隆兔抗人抗体,购自Santa Cruz公司,多克隆兔抗人p110α及hvps34抗体购自Abgent公司。过氧化物酶标记的链霉卵白素试剂盒和DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
  1.3 检测方法 免疫组化采用S-P法,依据说明书进行操作。Beclin1稀释倍数为1∶20。结果的判断所有切片采用盲法由两位病理科医生独立阅片,细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。结果采用两种方法:(1)染色结果判定:每例标本以400倍光镜下随意选取10个视野,计数每个视野中100个肿瘤细胞中的阳性细胞数,取其平均数求其阳性百分率作为结果。平均阳性细胞所占比例<5%为阴性,>5%判定为阳性。(2)在×100下观察全片,选择5个阳性物质丰富的视野,然后采用Image-Pro Plus 4.5分析软件在×400下测定阳性物质的积分光密度值(integrated optical density,IOD),计算平均IOD值。
  1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,比较采用t检验,计数资料采用 字2检验,理论频数小于5时采用Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 Beclin1在喉癌组织中的表达 Beclin1表达主要位于细胞浆,染色阳性物质呈棕黄色,Beclin1在正常喉组织中的表达较高,在喉癌中的表达减少,见图1~4。
  2.2 喉癌和正常喉组织Beclin1蛋白表达比较 与正常喉组织组比较,喉癌组中Beclin1表达的阳性率及量均明显降低,比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。
  2.3 喉癌中Beclin1表达与临床病理参数的关系 在临床分型中,喉癌声门上型、声门型、声门下型三组中Beclin1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);在组织学分化分组中,与低分化的喉癌比较,Beclin1在高、中分化的喉癌组织中的量及阳性率均明显增高表达(P<0.05);在T期分组中,T1+T2中Beclin1蛋白表达量及阳性率均显著高于T3+T4组(P<0.05);在有无淋巴结转移分组中,发生淋巴结转移的喉癌组织中Beclin1的表达量及阳性率均明显低于无淋巴结转移者(P<0.05),见表2。
  3 讨论
  自噬(autophagy)是将细胞内受损、变性或衰老的蛋白质以及细胞器运输到溶酶体进行消化降解,以胞质内出现自噬体为特征的细胞自我消化过程,生命体借此维持蛋白代谢平衡及细胞内环境的稳定。同时自噬还参与多种疾病的病理过程。最近的研究表明细胞自噬是肿瘤细胞逃避凋亡的一种重要机制,自噬活性的异常与肿瘤的发生有着直接的关系[3]。喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,近年发病有上升趋势,并且位置特殊、解剖复杂、功能重要、治疗复杂[4]。因此,研究自噬与喉癌的关系对喉癌进一步诊治有重要意义,笔者的研究就是在临床上进一步观察自噬基因Beclin1的表达与喉癌的关系。
  Beclin1是哺乳动物参与自噬的双等位抑癌基因,位于染色体17q21[5]。Aita等[4]发现22株乳腺癌细胞株中有9株存在Beclin1的等位基因缺陷,进而认为Beclin1为一肿瘤抑制基因。Liang等[6]发现在11种人乳腺癌细胞株中有8种细胞株Beclin1蛋白表达缺失,通过蛋白印迹对17例乳腺癌标本的Beclin1蛋白表达进行分析,发现15例Beclin1蛋白表达降低,而用免疫组化检测32例乳腺癌样本有18例Beclin1蛋白明显下调,证实了乳腺癌中存在Beclin1蛋白表达的特异性缺失,因此Beclin1蛋白表达下调在人乳腺癌中是常见的现象。自噬基因Beclin-1为杂合子的小鼠发生恶性肿瘤的风险增高;乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌患者Beclin-1等位基因缺失的比例高于健康人。笔者的研究采用免疫组化SP法对77例喉癌、22例正常喉组织中Beclin1的表达进行检测发现:该基因主要表达在正常喉组织细胞以及癌细胞中,间质中表达少见,在喉癌中的表达明显低于正常喉组织中的表达,提示自噬基因Beclin1在喉癌中表达下调[7-8]。   自噬不仅在调控肿瘤的生成有重要的作用,并且与肿瘤的生长和转移有关。在临床上,肿瘤的临床分期、组织学分级以及淋巴结转移等因素是喉癌恶性程度以及预后的重要指标[9-10]。患者临床分期越晚,组织学分化越差,其侵袭与转移能力也越强,预后越差[11]。本研究发现Beclin1的蛋白表达与喉癌的临床分型无相关性,但是T1+T2中Beclin1蛋白表达高于T3+T4组,表明Beclin1的蛋白表达与喉癌的T分期有显著相关性,表明Beclin1的表达与喉癌的临床进展有关。在不同分化喉癌组的比较中,高、中分化组与低分化组的比较时,Beclin1表达明显增高,表明肿瘤细胞分化程度越低,恶性程度越高,自噬能力也减弱地更加明显,提示Beclin1表达降低和喉癌的预后相关。喉癌患者淋巴结转移是其重要转移途径,本研究发现淋巴结转移组和非转移组相比,Beclin1表达降低,提示Beclin1表达降低与淋巴结转移相关。有研究表明,自噬可能是抑制肿瘤血管形成和分布的一种方式[12]。
  综上所述,自噬基因Beclin1在喉癌中的表达明显低于正常喉组织,Beclin1的缺失与喉癌的发生有关。自噬基因Beclin1阳性表达率与喉癌的T分期、分化程度及淋巴结转移相关,当Beclin1表达下调时肿瘤的恶性程度更高,更容易发生进展和转移。进一步研究自噬基因Beclin1对喉癌细胞生物学行为的影响,对进一步探索喉癌的治疗有积极意义。
  参考文献
  [1] Woodard T D,Oplatek A,Petruzzelli G J.Life after total laryngectomy:a measure of long-term survival,function,and quality of life[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2007,133(6):526-532.
  [2] Chu E A,Kim Y J.Laryngeal cancer:diagnosis and preoperative work-up[J].Otolaryngol Clin North Am,2008,41(4):673-695.
  [3] Lockshin R A,Zakeri Z.Apoptosis,autophagy,and more[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2405-2419.
  [4] Aita V M,Liang X H,Murty V,et al.Cloning and genomic organization of Beclin1,a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21[J].Genomics,1999,59(1):59-65.
  [5] Xia P,Wang S,Du Y,et al.WASH inhibits autophagy through suppression of Beclin1 ubiquitination[J].EMBO J,2013,32(20):2685-2696.
  [6] Liang X H,Jackson S,Seaman M,et al.Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin1[J].Nature,1999,402(6762):672-676.
  [7] Qu X,Yu J,Bhagat G,et al.Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin1 autophagy gene[J].J Clin Invest,2003,112(12):1809-1820.
  [8] Yue Z,Jin S,Yang C,et al.Beclin1,an autophagy gene essential for early embryonic development,is a haploinsufficient tumor suppressor[J].Proc Natl Acad Sci,2003,100(25):15077-15082.
  [9] Richard J M,Sancho-Garnier H,Pessey J J,et al.Randomized trial of induction chemotherapy in larynx carcinoma[J].Oral Oncol,1998,34(3):224-228.
  [10] Cohen S M,Garrett C G,Dupont W D,et al.Voice-related quality of life in T1 glottic cancer:irradiation versus endoscopic excision[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2006,115(8):581-586.
  [11] Lin H X,Qiu H J,Zeng F,et al.Decreased expression of Beclin1 correlates closely with Bcl-xL expression and poor prognosis of ovarian carcinoma[J].PloS one,2013,8(4):e60516.
  [12] Chau Y P,Lin S Y,Chen J H C,et al.Endostatin induces autophagic cell death in EAhy926 human endothelial cells[J].Histol Histopathol,2003,18(3):715-726.
  (收稿日期:2013-11-25) (本文编辑:欧丽)
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