黄芪当归不同配伍对气虚血瘀证大鼠血液流变学及血清干扰素—γ、白细胞介素—4的影响

来源:用户上传      作者: 袁颖等

　　摘要：目的 探讨黄芪当归配伍对气虚血瘀证大鼠血流动力学的改善及对Th1/Th2细胞的调节作用。方法 采用限食+强迫游泳+皮下注射肾上腺素方法造成大鼠气虚血瘀证模型，分别用不同比例黄芪当归配伍灌胃给药治疗21 d。用血流变仪测定血液流变学指标，ELISA法测定血清中干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）含量。结果 服药21 d后，与模型组比较，芪归1∶1组、芪归3∶1组、芪归5∶1组血流变低切指标明显减小，血黏度明显改善。模型组大鼠脾指数、胸腺指数均明显减小，而芪归5∶1组服药后脾指数明显上升。模型组IFN-γ降低，IL-4升高，以Th2细胞反应占优势；芪归3∶1组、芪归5∶1组能升高血清IFN-γ含量，芪归5∶1组能降低IL-4含量。结论 黄芪当归配伍对气虚血瘀证大鼠模型具有改善血液流变及增强免疫作用，并且可以调节Th1/Th2细胞平衡。其中以黄芪比例大于当归时效果较好，综合作用芪归5∶1组最佳。
　　关键词：黄芪；当归；气虚血瘀证；血液流变学；干扰素-γ；白细胞介素-4；大鼠
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.016
　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0044-03
　　黄芪，性甘温，归脾、肺经，可补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌。当归，性甘温，归肝、心、脾经，可补血活血、调经止痛、润肠通便。黄芪当归配伍，为临床所常用，除当归补血汤外，补中益气汤、归脾汤、补阳还五汤等方剂中此药对均为方
　　基金项目：上海市教育委员会科研创新项目（09YZ120）；教育部科技发展中心博士专项基金（20093107120013）
　　中重要组成部分。Th1/Th2细胞平衡对整个免疫系统的调节起着关键性的作用。当Th1/Th2细胞因各种原因失衡时，免疫系统的稳定性即遭到破坏，机体便会出现一系列病变。由此可认为，Th1/Th2平衡调节即为阴阳平衡调节的一个方面[1]。Thl/Th2漂移的概念即是指Th1/Th2的动态平衡被打破，偏向于Th1或Th2优势应答。研究药物对Th1/Th2细胞平衡的调节近来也成为中医药研究新的热点之一。本研究选取气虚血瘀证大鼠模型，探讨气虚血瘀证状态下的Thl/Th2漂移情况，以及芪归药对不同配比对Thl/Th2漂移的影响。
　　1 实验材料
　　1.1 动物
　　健康SD大鼠，清洁级，雄性，66只，体质量（200±10）g，上海必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXP（沪） 2008-0005。
　　1.2 主要试剂与仪器
　　盐酸肾上腺素注射液（1 mg/mL，上海禾丰制药有限公司），白细胞介素-4（IL-4）大鼠ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），干扰素-γ（IFN-γ）大鼠ELISA试剂盒（invitrogen）。LBY-N6B型全功能自动血流变仪（北京普利生仪器有限公司），酶标仪（BIO-TEX INSTRUMENTS）。
　　1.3 药物
　　黄芪、当归饮片均购自上海康桥饮片厂，产地：甘肃，批号091211、091128。经上海市食品药品检验所吴赵云研究员鉴定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge. vsr. mongholicus （Bge.） Hsiao的干燥根。当归为伞形科植物当归 Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根。中药水煎剂：黄芪当归药材按1∶2、1∶1、3∶1、5∶1比例分别混合，总量均为300 g。加8倍量水煎煮。水煎2次，每次40 min。煎好后过滤去渣。将2次煎液混合，浓缩至300 mL。使药液浓度为1 g原药材/mL。
　　2 实验方法
　　2.1 分组
　　实验大鼠随机分为空白组、模型组、芪归1∶2组、芪归1∶1组、芪归3∶1组、芪归5∶1组，每组11只。
　　2.2 造模
　　根据文献[2-3]方法加以改进。除空白组动物外，第1周（第1日）开始控制食入量，大鼠每日摄正常食量的1/2左右（约50 g/kg体质量）。除空白组动物外，第2周（第8日）开始在控制食量的基础上，放入自来水（20±5）℃中游泳，以每只出现自然沉降的时间为其游泳耐疲劳时间。当每组50%的大鼠出现自然沉降时全组停止游泳。连续21 d。除空白对照组动物外，第3周（第15日）开始每只大鼠在游泳前皮下注射0.01%盐酸肾上腺素0.4 mL/kg，共持续14 d。第29日不游泳，取血。根据动物精神状态、毛发变化、体质量情况、游泳持续时间等一般情况，结合血液流变学改善判断模型是否成功[2]。实验过程中模型组、芪归3∶1组、芪归5∶1组分别有1～2只动物在造模过程中死亡。
　　2.3 给药
　　根据人与大鼠体表面积比计算给药量。实验第2周开始，除空白对照组动物及模型组动物外，每组动物给予10 g原药材/kg相应中药水煎剂，每日1次，共21 d。空白组及模型组灌服同体积蒸馏水。
　　2.4 取材
　　于实验第29日，用25%乌拉坦（按4 mL/kg体质量）进行腹腔麻醉。腹主动脉取血8 mL，其中4 mL，置于肝素抗凝管内于冰上保存，直至测定。其余全血室温静置2 h后，3500 r/min离心20 min，吸取上清，置-20 ℃冰箱保存直至测定。采血后处死大鼠，剥离大鼠胸腺和脾脏备用。
　　2.5 计算脏器指数
　　剥离胸腺和脾后立即用电子天平称重，按下列公式计算脏器指数。
　　胸腺指数=胸腺质量（mg）÷体质量（kg）
　　脾指数=脾质量（mg）÷体质量（kg）
　　2.6 血液流变学指标检测 　　应用LBY-N6B全自动自清洗血流变仪，按操作流程检测。选用低（10s-1）、中（60s-1）、高（120s-1）3个切变率。
　　2.7 血清干扰素-γ、白细胞介素-4含量检测
　　根据ELISA试剂盒说明书操作。酶标仪450 nm检测。
　　3 统计学方法
　　采用SPSS11.0统计软件进行分析。数据以—x±s表示，组间比较采用方差齐性检验及方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　4 结果（见表1～表3）
　　5 讨论
　　气虚血瘀证是中医常见证型之一，现代研究认为，气虚血瘀证可能与炎症因子及其他细胞因子的异常有关[4-7]。气虚血瘀证动物模型的制备多以单一因素或复合因素诱导[2，8]。本研究采用限食+强迫游泳+皮下注射肾上腺素方法造模。研究发现第2周开始，模型组大鼠力竭游泳后体质量下降，原因在于强迫大鼠长时间大运动量运动，使之过度疲劳可耗气伤精，造成全身性气虚，劳累之后更加纳呆食差，导致生气乏源。在全血黏度方面，模型组在低切、中切、高切指标中与空白对照组相比均明显增大，提示模型组血液流动阻力较大，流动性差，存在血瘀表现。说明本研究造模成功。实验还表明，造模4周后模型组大鼠胸腺、脾指数明显降低，存在着免疫功能缺陷。
　　从分子免疫学角度看，Th1细胞占优势时，表现促炎为主，具有清除多种致病原的作用，主要抑制感染的发展，有助于病情康复或慢性感染的建立[9]；Th2细胞占优势时，表现抗炎为主，产生各种病理产物，倾向于引起严重的病理改变。Th1/Th2失衡能够反映机体免疫功能状态的改变。当由于各种原因导致Th1/Th2细胞失衡时，免疫系统的稳定性遭到破坏，机体便会出现一系列病变[10]。本研究发现，气虚血瘀证大鼠模型Th1/Th2细胞平衡出现偏移，IFN-γ降低，IL-4升高，以Th2细胞反应占优势。说明在气虚血瘀证状态下，机体出现“本虚标实”的病理变化，在Th1/Th2细胞平衡方面向Th2细胞偏移，可为气虚血瘀证病理机制研究及药物干预研究提供一定的理论基础。
　　黄芪当归药对对Thl/Th2漂移影响的研究报道不多，仅见于黄芪和当归单味药的研究中。黄芪可以增强哮喘大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的功能，改善Th1和Th2型细胞因子的平衡，从而调节了神经内分泌-免疫网络的紊乱[11]。黄芪总黄酮（TAF）能够重建免疫功能低下小鼠的免疫功能，促进机体Th0向Th1分化，维持Th1的优势状态，增强机体的细胞免疫功能[12]。当归多糖组分AP-3能显著促进小鼠脾淋巴细胞、巨噬细胞、混合淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖反应，而对B细胞增殖有一定的抑制作用；显著增加培养的脾细胞中CD4+T细胞亚群的比例[13]。
　　本研究发现，服药21 d后芪归1∶1组、芪归3∶1组、芪归5∶1组血流变低切指标明显减小，血黏度有明显改善。各组大鼠脾指数、胸腺指数均明显减小，均存在免疫功能缺陷，而芪归5∶1组服药后脾指数明显上升，免疫功能有所改善。IFN-γ、IL-4分别作为Th1和Th2的代表性细胞因子，气虚血瘀证大鼠模型Th1/Th2细胞平衡出现偏移，IFN-γ降低，IL-4升高，以Th2细胞反应占优势。芪归3∶1组、芪归5∶1组能升高血清IFN-γ含量，芪归5∶1组能降低IL-4含量，纠正Th1/Th2细胞平衡由Th2向Th1逆转。 综上所述，黄芪当归配伍对气虚血瘀证大鼠模型具有改善血液流变及增强免疫作用，并且可以调节Th1/Th2细胞平衡。其中以黄芪比例大于当归时效果较好，而芪归5∶1组在各方面均有较好作用。
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　　（收稿日期：2013-04-15，编辑：华强）
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