复骨方促进糖皮质激素性骨质疏松大鼠骨折愈合作用的研究

来源:用户上传      作者: 朱冰 李敏研(等)

　　[摘要] 目的 探讨中药复骨方对糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）大鼠骨折愈合的促进作用。 方法 将48只SD大鼠随机分为三组，各16只。前8周实验中，基础组仅给予肌内注射生理盐水1 mg/kg，模型组和治疗组肌内注射地塞米松1 mg/kg，1次/d，3次/周，建立GIOP动物模型。第8周末对三组大鼠手术造成单侧股骨闭合性骨折，骨折处采用金属内固定，建立GIOP骨折动物模型。术后第2天开始，基础组和模型组给予蒸馏水10 mL/kg灌胃，治疗组以复骨方药液灌胃给药，持续8周。观察各组股骨骨密度（BMD）变化，影像学观察骨折愈合情况，比较各组骨组织形态计量学参数和生物力学测量结果。 结果 治疗组股骨全长骨BMD高于模型组，差异有统计学意义（t = 11.2532，P < 0.05）。模型组大鼠股骨骨小梁面积百分数（TbAr%）、骨小梁数量（TbN）、平均骨小梁厚度（TbTh）均较基础组下降，骨小梁分离度（TbSp）较基础组增高，差异有统计学意义（t = 3.5885、7.4488、9.0512、10.0270，P < 0.05）；治疗组TbAr%、TbN、TbTh均高于模型组，TbSp低于模型组，两组各指标比较差异有统计学意义（t = 2.3329、5.3328、5.9512、10.9590，P < 0.05）。模型组的最大载荷、最大挠度及最大应力均较基础组降低，差异有统计学意义（t = 3.8944、5.3915、4.4739，P < 0.05）；治疗组的最大载荷、最大挠度及最大应力均高于模型组，差异有统计学意义（t = 2.9251、3.7628、6.6926，P < 0.05）。 结论 中药复骨方可提高GIOP骨折大鼠的BMD，改善骨微结构，提高骨生物力学性能。中药复骨方对GIOP骨折的愈合有促进作用。
　　[关键词] 复骨方；骨折；愈合；骨组织形态计量学；生物力学；糖皮质激素性骨质疏松
　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）10（a）-0014-05
　　Effects of Chinese Medicine Fugu Prescription on fracture healing of rats with glucocorticoid-induced osteoporosis
　　ZHU Bing1 LI Minyan1 LIU Zhihua2 SHI Jingwen3
　　1.Department of Pharmacy， Panyu District Hexian Memorial Hospital of Guangzhou City， Guangdong Province， Guangzhou 511400， China； 2.Department of Surgery， Panyu District Hexian Memorial Hospital of Guangzhou City， Guangdong Province， Guangzhou 511400， China； 3.Department of Laboratory， Guangdong Pharmaceutical University， Guangdong Province， Guangzhou 510006， China
　　[Abstract] Objective To observe the effects of Chinese Medicine Fugu Prescription on fracture healing of rats with glucocorticoid-induced osteoporosis （GIOP）. Methods 48 SD rats were randomly divided into 3 groups， with 16 rats in each group. Rats of basic group were received intramuscular injection of 1 mg/kg saline. Rats of other groups given intramuscular injection of Dexamethasone （1 mg/kg， once a day， 3 times a week） for 8 weeks to establish GIOP animal model. In the end of 8th week， all rats were established the bone fracture in the middle of right femora. On the 2nd day of modeling， basic and model group were given distilled water 10 mL/kg by intragastric administration， treatment group was given Chinese Medicine Fugu Prescription， once per day for 8 weeks. Bone mineral density （BMD） was examined by dual-energy X-ray absorptiometry. Rats were sacrificed after fracture 8 weeks， femurs were removed for biomechanics test and morphologic observation. Results The BMD value of mice femora in the treatment group was higher than that in the model group， there was statistically significant difference between them （t = 11.2532， P < 0.05）. The area percent of trabecular （TbAr%）， the number and the thickness of trabecular （TbN， TbTh） in the model group were all lower than those in the basic group， but the trabecular bone space （TbSp） was higher than that in the basic group， there were statistically significant differences （t = 3.5885， 7.4488， 9.0512， 10.0270， P < 0.05）. The TbAr%， TbN， TbTh in the treatment group were higher than those in the model group， while TbSp was lower than that in the model group， there were statistically significant differences （t = 2.3329， 5.3328， 5.9512， 10.9590， P < 0.05）. The maximum load， the maximum deflection and maximum stress in model group were lower than those in the basic group， there were statistically significant differences （t = 3.8944， 5.3915， 4.4739， P < 0.05 ）. The maximum load， the maximum deflection and maximum stress in the treatment group were higher than those in the model group， there were significant differences （t = 2.9251， 3.7628， 6.6926， P < 0.05）. Conclusion Chinese Medicine Fugu Prescription can increase BMD of GIOP rats with bone fracture， improve bone microstructure， improve bone biomechanical properties. Chinese Medicine Fugu Prescription can promote fracture healing of rats with GIOP. 　　[Key words] Chinese Medicine Fugu Prescription； Fracture； Healing； Bone histomorphometry； Biomechanics test； Glucocorticoid-induced osteoporosis
　　糖皮质激素（Glucocorticoid，GC）具有抗炎、抗病毒、抗免疫、抗休克等多种作用，由于GC良好和独特的药理作用，很多患者必须长期服用，大剂量长期使用糖皮质激素会对骨骼产生不良影响，造成糖皮质激素性骨质疏松，引发病理性骨折。目前，GC已成为继发性雌激素缺乏、老年因素之后导致骨质疏松症的第三大原因[1]。有调查表明，20%的患者在口服GC后的前12个月内发生了骨质疏松性骨折[2]，口服GC 5～10年后这一比例上升至50%[3]。骨折是糖皮质激素性骨质疏松症（GIOP）最严重的副作用之一，GC引起的骨折常常延迟愈合，致残率极高，又缺乏有效的预防和治疗方法。GIOP所致骨折是临床常见疾患，其发病急、愈合难，是骨科临床领域的一项难题。本研究以肌内注射地塞米松致大鼠GIOP，并建立GIOP大鼠股骨闭合骨折模型，观察分析中药复骨方促进模型大鼠骨折愈合的作用机制，为临床治疗GIOP骨折探索新的药物。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物
　　选取3个月龄雌性SD大鼠48只，清洁级，体质量（280±20） g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002。实验过程中，所有动物在同等清洁环境下分笼饲养，饲养房温度（24±1）℃，湿度50%～70%，每天光照与黑暗时间各12 h，喂饲全价营养鼠饲料（购自广东中医药大学实验动物中心，合格证号：No.11002900006734），自由进水。在动物处死前第3、4天及第13、14天颈部皮下注射钙黄绿素20 mg/kg，进行体内荧光标记。
　　1.2 实验药物
　　地塞米松磷酸钠注射液（天津药业集团新郑股份有限公司，国药准字号H41021255，批号0807031）；青霉素（广州白云山天心制药股份有限公司，国药准字号H20013260）；麻醉剂水合氯醛为国产分析纯，3.5%水合氯醛（天津科密欧化学试剂有限公司生产，批号20110514）。
　　实验用中药复骨方由骨碎补、杜仲、续断、千年健、红花、归尾、川芎等组成，药材购自广州大参林药房，由广州市番禺区何贤纪念医院药房加工，药物煎煮后浓缩到含生药0.5 g/mL药液，4℃保存。
　　1.3 试剂与仪器
　　钙黄绿素（美国Sigma公司，规格5 g，批号C0875）。实验仪器：双能X线仪DEXA（LUNAR-DPXIQ型，美国GE Lunar公司）；SP1600型切片机（德国Leica公司）；RM2500型包埋机（德国Leica公司）；J-D200生物显微镜（深圳拓天仪器设备有限公司）；TE2000型荧光显微镜（日本Nikon公司）；计算机X射线摄像仪（日本柯尼卡美能达公司）；骨组织形态计量仪（型号OLYMPUS BX-51，美国BIOQUANT公司）；EleetroForce 3200生物材料实验仪（美国Bose Corporation公司）；骨折造模支架参照文献[4]制作。
　　1.4 方法
　　1.4.1 分组及建模 将实验动物随机分为3组，基础组、模型组和治疗组，各16只。每周称体重1次，并按体重调整给药剂量。基础组：给予肌内注射生理盐水1 mL/（kg・d），3次/周，8周后按照文献[4]方法手术造成大鼠右侧股骨骨折，骨折处采用金属内固定，术后3 d常规抗感染处理，予肌内注射青霉素100万U/kg。术后第2天开始给予蒸馏水10 mL/kg 灌胃，1次/d，持续8周。模型组：予肌内注射地塞米松（DEX）1 mg/kg，1次/d，3次/周，8周后手术造成大鼠右侧股骨骨折，骨折处采用金属内固定，术后常规抗感染处理同基础组，术后第2天开始给予蒸馏水10 mL/kg灌胃，1次/d，持续8周。治疗组：前8周造模同模型组，骨折术后第2天以中药复骨方药液10 mL/kg灌胃给药，1次/d，持续8周。
　　1.4.2 骨密度测定 实验8周末基础组和模型组大鼠腹腔注射麻醉剂，以双能X射线吸收仪及所附带的小动物软件测量大鼠活体全身骨密度（BMD），验证骨质疏松模型的建立是否成功。16周末麻醉后处死大鼠，在无菌条件下取双侧股骨，4℃避光保存在70%乙醇中，应用DEXA以右侧股骨骨痂为中心，扫描2 cm阶段，测定骨痂骨密度值。骨密度采用单位面积内的骨矿物质含量表示（g/cm2）。
　　1.4.3 放射学观察 骨折术后8周，在麻醉状态下，大鼠俯卧位，双下肢分开，膝关节微屈曲，用X线机拍右侧股骨CR片，摄片条件为：投射球管距离标本90 cm，电压45 kV，电流3.2 mA；观察大鼠骨痂生长及骨折愈合情况。
　　1.4.4 骨组织形态计量学检测 实验16周末将大鼠按期处死后剥离股骨，分离股骨及所附着的组织，截取股骨干骺端组织，生理盐水冲洗后，进行固定、乙醇梯度脱水，石蜡包埋，Leica机连续切片（5 μm），采用甲苯胺蓝染色，在光学显微镜和荧光显微镜下观察其形态学改变，应用数字图像分析系统测定骨组织形态参数。
　　1.4.5 生物力学测量[5] 16周末大鼠按期处死后剥离股骨，取术侧股骨，剔除软组织，拔除加锁髓内针，湿生理盐水纱布包裹-20℃冰箱保存备用。采用Electro Force 3200生物材料实验仪分别行术侧股骨三点弯曲实验，支点跨距为20 mm，中央垂直（股骨与载荷成90°角）施加载荷，速率5 mm/min，测量和运算出各样本的最大载荷、最大挠度和最大应力。
　　1.5 统计学方法
　　应用SSPS 12.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果
　　2.1 实验大鼠骨密度的变化
　　骨折术前模型组与基础组大鼠骨密度比较：实验第8周末骨折术前，模型组大鼠BMD值为（0.219±0.013）g/cm2，基础组BMD值为（0.283±0.015）g/cm2，模型组骨密度值显著低于基础组，差异有统计学意义（t = 12.8970，P < 0.05），说明GIOP模型建立成功。
　　实验16周末各组大鼠股骨骨密度比较：治疗组股骨BMD高于模型组，模型组BMD低于基础组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表1。
　　表1 实验16周末各组大鼠股骨骨密度比较（g/cm2，x±s）
　　注：t1为基础组与模型组比较；t2为治疗组与模型组比较
　　2.2 放射学检查结果
　　实验16周末，三组大鼠骨折部位愈合良好，骨折对位对线好，治疗组、基础组骨折部位的骨痂皮质厚于模型组，治疗组与基础组骨痂厚度无明显差异。见图1。
　　①基础组；②模型组；③治疗组
　　图1 实验16周末三组大鼠骨折部位CR片
　　2.3 骨组织形态计量学结果比较
　　骨折术后8周，模型组大鼠股骨骨小梁面积百分数（TbAr%）、骨小梁数量（TbN）、平均骨小梁厚度（TbTh）均较基础组下降，骨小梁分离度（TbSp）较基础组增高，差异有统计学意义（P < 0.05）；治疗组TbAr%、TbN、TbTh均高于模型组，TbSp低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
　　表2 各组大鼠股骨骨形态计量学测量结果比较（x±s）
　　注：t1为基础组与模型组比较；t2为治疗组与模型组比较
　　2.4 大鼠股骨生物力学测量比较
　　骨折术后 8 周对三组大鼠术侧股骨进行生物力学比较，模型组和治疗组的最大载荷、最大挠度及最大应力均低于基础组，但治疗组结果显著高于模型组，模型组与基础组、治疗组与模型组间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。
　　3 讨论
　　骨质疏松症是公认的社会公共卫生健康问题，其发病率位居世界各种常见病的第6位[6]。继发性骨质疏松症是由于疾病或药物等原因所致的骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加和易于骨折的代谢性疾病[7]。引起继发性骨质疏松症的病因很多，由于GC在临床上的广泛使用，GIOP的发病率亦逐年提高，并成为最常见的继发性代谢性骨病[8]。骨折是骨质疏松的主要并发症，骨折的发生率在服用糖皮质激素的最初3～6个月即明显增加[9]。骨质疏松性骨折以椎骨、腕部及髋部多见，其中以髋部骨折的发生率最高。英国的调查资料显示，75岁以上女性每年有1%发生髋部骨折，髋部骨折占骨折病患的15%～25%[10]。骨质疏松症患者骨强度低，抗骨折能力差，骨折发生率高，愈合慢，易发生内固定松动和再骨折，致残率较高。
　　骨密度是反映骨量的主要指标，与骨折危险度密切相关。本实验对大鼠肌注地塞米松8周后，模型组大鼠骨密度显著降低，说明大鼠骨质疏松模型复制成功。实验16周末，治疗组股骨全长骨和骨痂BMD均高于模型组，说明复骨方治疗可有效提高模型大鼠的BMD，促进骨折的愈合。
　　骨的力学强度和骨痂内骨结构是反映骨折愈合的重要指标，骨骼生物力学性能降低是骨折发生的主要原因之一[11]。骨组织形态计量学是应用数学和几何学的方法，研究骨骼组织的结构和骨量等形态学静态特性的测量技术[12]。三点弯曲试验是生物力学中常用的方法。最大载荷反映了骨的刚度，最大应力反映骨质的内在硬度[13]。本实验生物力学检测以及骨形态计量学观察结果显示：骨折术后8周，治疗组大鼠股骨TbAr%、TbN、TbTh均较模型组提高，TbSp较模型组下降，而模型组TbAr%、TbN、TbTh数据较基础组降低，TbSp较基础组升高；治疗组最大载荷、最大挠度及最大应力结果显著高于模型组。实验结果提示，GC可使模型大鼠骨小梁数量、厚度减少，骨量减少，骨小梁分离度增加，骨强度降低，大鼠股骨生物力学性能下降，因而GIOP大鼠骨折风险增大。经中药复骨方治疗后，治疗组大鼠的骨形态参数有所改善，骨量增加，骨小梁分离度降低，连接性加强，骨微结构得到加强改善，实验大鼠的力学性能显著提高，因此，中药复骨方可促进模型大鼠骨折愈合。
　　我国传统医药治疗骨质疏松、骨折历史悠久，清代陈士铎在《百病辨证录》中对骨折的治疗提出了“血不活则瘀不去，瘀不去则新不能生，新不能生则骨不能合”。因此，中药多应用补肾和活血化瘀类药物治疗骨折。中药复骨方由骨碎补、杜仲、续断、千年健、红花、归尾、川芎等组成，方中骨碎补能提高血钙、血磷水平，激活成骨细胞，能明显增加骨小梁宽度和密度， 减少骨小梁间隙[14]。杜仲能在骨折早期降低血钙，升高血磷，促进骨痂生长和骨折愈合[15]。研究发现，续断能有效促进大鼠成骨细胞分化、增殖，防止成骨细胞凋亡[16]，促进骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化[17]，并且在一定的浓度范围内可以促进人成骨细胞的分化和增殖[18]。千年健能够增加成骨细胞和骨髓基质细胞（MSC）护骨素（OPG）蛋白及其mRNA表达，抑制细胞核因子-κB受体活化因子配基（RANKL）蛋白及其mRNA的表达，使骨形成大于骨吸收[19]。复骨方组方合理，以骨碎补、杜仲、续断和千年健强肾壮骨，同时配伍归尾、川芎和红花行气活血，化瘀止痛。
　　本实验结果证实，中药复骨方能够提高GIOP骨折大鼠的BMD，增加骨小梁数量，使骨小梁增粗，骨小梁间隙变窄，改善骨的显微结构，增强骨强度，提升骨生物力学性能。因此，中药复骨方对模型大鼠骨折的愈合有促进作用。
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　　（收稿日期：2014-06-23 本文编辑：程 铭）
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