中药复骨方对糖皮质激素致骨质疏松骨折大鼠骨代谢及骨密度的影响

来源:用户上传      作者: 邓伟坤 李艳卿 李敏研 施静雯

　　[摘要] 目的 观察中药复骨方对糖皮质激素致骨质疏松骨折模型大鼠骨代谢及骨密度的影响。 方法 将48只SD大鼠随机分为基础组、模型组及治疗组各16只。基础组仅给予肌内注射生理盐水1 mg/kg，模型组和治疗组予肌内注射地塞米松1 mg/kg，1次/d，3次/周，用药8周建立糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）模型。第8周末对3组大鼠手术造成单侧股骨闭合性骨折，骨折处采用金属内固定，复制GIOP骨折模型。术后第2天开始治疗组中药复骨方药液灌胃，持续8周。检测大鼠血清钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）指标，采用双能X线吸收法（DXA）测量大鼠股骨骨密度。 结果 骨折术前，模型组大鼠骨密度值为（0.219±0.013） g/cm2，基础组骨密度值为（0.283±0.015） g/cm2，模型组骨密度值明显低于基础组（t=12.8970，P<0.05）。实验16周末，治疗组股骨全长骨骨密度为（0.265±0.014） g/cm2，高于模型组（t=9.8403，P<0.05）。实验12周末，治疗组大鼠血清Ca为（2.35±0.19） mmol/L、P为（2.47±0.23） mmol/L、ALP为（196.74±25.38） U/L及BGP为（1.33±0.25） μg/L，与模型组比较均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 中药复骨方可显著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高GIOP骨折大鼠血清Ca、P、ALP及BGP活性，促进骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。
　　[关键词] 复骨方；骨代谢；骨密度；糖皮质激素性骨质疏松；骨折；大鼠
　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）10（b）-0008-04
　　骨质疏松是骨代谢障碍的一种全身性骨骼疾病，骨骼是动态变化的组织，骨转换过程是破骨细胞吸收旧骨、成骨细胞形成类骨质并进行矿化新骨的过程，当骨吸收大于骨形成就导致了骨质疏松症的发生。糖皮质激素性骨质疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是一种因内源或外源糖皮质激素所致的，以骨强度下降、骨折风险性增加为特征的代谢性骨病[1]，其发病率位居继发性骨质疏松症首位[2]。骨转换过程可以通过生化标志反映出来，间接显示成骨细胞与破骨细胞的活性，与骨形成有关的代谢指标有碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（BGP）等。本实验拟以肌内注射地塞米松致大鼠GIOP，并建立GIOP大鼠股骨闭合骨折模型，观察中药复骨方对模型大鼠骨代谢及骨密度的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 实验动物 选取3个月龄雌性SD大鼠48只，清洁级，体质量（280±20） g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002。实验过程中，所有动物在同等清洁环境下分笼饲养，饲养房温度为（24±1）℃，湿度为50%～70%，每天光照与黑暗时间各12 h，喂饲全价营养鼠饲料（购自广东中医药大学实验动物中心，合格证号：NO.11002900006734），自由进水。
　　1.1.2 实验药物 实验中药复骨方由骨碎补、杜仲、续断、千年健、红花、归尾、川芎等组成，药材购自广州大参林药房，由广州市番禺区何贤纪念医院药剂科药房加工，药物煎煮后浓缩到含生药0.5 g/ml，4℃保存。地塞米松磷酸钠注射液（天津药业集团新郑股份有限公司生产，国药准字号H41021255，批号0807031，规格：1 ml∶5 mg）；生理盐水（广东科伦药业有限公司生产，国药准字号H20045198，批号D12070311-2，规格：500 ml∶4.5 g）；青霉素（广州白云山天心制药股份有限公司生产，国药准字号H20013260）；麻醉剂3.5%水合氯醛（天津科密欧化学试剂有限公司生产，批号20110514）。
　　1.1.3 试剂仪器 血清钙（Ca）、磷（P）、ALP试剂盒（批号：20130708、20131016、2130915，由南京建成生物技术公司提供）；血清BGP放免试剂盒（购自北京原子高科股份有限公司，批号：201311）。实验仪器：日立7600全自动生化仪；离心机（型号：TDZ5-WS，长沙平凡仪器有限公司）；XH6080型放免仪（西安核仪厂）；双能X线仪DEXA（LUNAR-DPXIQ型，美国GE Lunar公司）；骨折造模支架参照相关文献[3]自制。
　　1.2 方法
　　1.2.1 建模方法 将实验动物随机分为基础组、模型组及治疗组各16只。每周称体质量1次，并按体质量调整给药剂量。基础组：肌内注射生理盐水1 ml/（kg・d），3次/周，8周后手术造成大鼠右侧股骨骨折，骨折处采用金属内固定，术后3 d常规抗感染处理，每日肌内注射1 000 000 U青霉素。术后第2天开始给予蒸馏水10 ml/kg灌胃，1次/d，持续8周。模型组：肌内注射地塞米松1 mg/（kg・d），3次/周，持续8周，复制GIOP模型。8周末手术造成GIOP大鼠右侧股骨骨折，骨折处采用金属内固定，术后常规抗感染处理同基础组，术后第2天开始给予蒸馏水10 ml/kg 灌胃，1次/d，持续8周。治疗组：前8周GIOP骨折造模及骨折术后抗感染处理同模型组。骨折术后第2天以复骨方药液10 ml/kg灌胃给药，1次/d，持续8周。
　　1.2.2 骨折手术方法 应用3.5%水合氯醛（10 ml/kg）对实验大鼠进行腹腔麻醉，纵行切开右下肢髌骨内侧皮肤（长0.6～0.8 cm）及部分股四头肌腱性组织，将髌骨牵向外侧使之脱位，暴露股骨髁间凹。用20号注射针自股骨髁间凹插入髓腔扩髓，然后取出，再逆行插入直径1 mm克氏针，从大转子及皮肤穿出，将内固定针远端埋于股骨髁间骨皮质下，近端紧贴大转子将尾部折弯，多余部分剪除后闭合切口。将动物右下肢外展内旋位固定于造模支架的铁砧凹槽上（铁砧凹槽间距为15 mm），造模支架中柱下端的骨刀压于大鼠股骨中部，助手提起500 g的砝码，从至20 cm高处将砝码自由落体撞向刀背，造成实验大鼠股骨中段闭合性骨折[3]。 　　1.2.3 血样本采集及血生化指标检测方法 实验8周末骨折手术前1天及实验12周末对3组动物采血。方法：以3.5%的水合氯醛溶液10 ml/kg腹腔注射麻醉，由腹主动脉取血，血样静置后2500 r/min离心20 min，分离出血清，置-40℃保存，按照试剂盒说明应用全自动生化仪检测Ca、P和ALP含量，BGP活性采用放射免疫法检测。
　　1.2.4 骨密度测定 实验8周末对基础组和模型组的大鼠腹腔注射麻醉剂，采用双能X线吸收法（DEXA）以LUNAR-DPXIQ型骨密度仪及所附带的小动物软件测量大鼠活体全身骨密度，验证骨质疏松模型的建立是否成功。16周末注射麻醉剂，处死大鼠，在无菌条件下取双侧股骨，剔除附着组织，拔除克氏针，4℃避光保存在70%乙醇中，应用DEXA分别测量右侧股骨全长骨密度及骨痂骨密度（骨痂中点上下10 mm处骨密度）。骨密度采用单位面积内的骨矿物质含量表示（g/cm2）。
　　1.3 统计学处理
　　采用SSPS 12.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 实验大鼠骨密度的变化
　　实验8周末骨折术前，模型组大鼠骨密度值为（0.219±0.013） g/cm2，基础组骨密度值为（0.283±0.015） g/cm2，模型组骨密度值明显低于基础组，差异有统计学意义（t=12.8970，P<0.05），说明GIOP模型复制成功。实验16周末，治疗组股骨全长骨和骨痂骨密度均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组全长骨和骨痂骨密度均低于基础组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。
　　表1 实验16周末3组大鼠股骨骨密度值的比较（g/cm2，x±s）
　　与基础组比较，t=11.2532，*P<0.05；t=13.7601，#P<0.05；与模型组比较，t=9.8403，△P<0.05；t=9.4618，▲P<0.05
　　2.2 实验中大鼠血清生化指标的改变
　　实验8周末，GIOP造模期，模型组、治疗组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性与基础组比较均显著降低（P<0.05）；实验12周末，治疗组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性与模型组比较均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性显著低于基础组，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。
　　表2 实验中3组大鼠血清生化指标的比较（x±s）
　　与基础组对应时间比较，*P<0.05；与基础组8周末比较，#P<0.05；与模型组12周末比较，△P<0.05
　　3 讨论
　　糖皮质激素所致骨质疏松症是最常见的药源性骨质疏松[4]。美国国立卫生研究院（NIH）将骨质疏松定义为一种以骨强度受损、骨折危险增加的骨骼疾病[5]，而骨强度是骨密度和骨质量的综合反映。骨密度即单位骨面积所含的骨矿物量，是反映骨强度与骨量的主要指标，是目前用于骨质疏松诊断、骨折危险度评价的重要指标[6]。本实验对大鼠肌内注射地塞米松8周后，模型组大鼠骨密度显著降低，血清生化检查提示模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性与基础组比较均显著降低，模型组骨代谢呈现一种低骨形成和高骨吸收的状态，说明大鼠骨质疏松模型复制成功，与国内相关研究建模方法一致[7-9]。实验16周末，治疗组股骨全长骨和骨痂骨密度均高于模型组，说明复骨方治疗可有效提高模型大鼠的骨密度，促进骨折的愈合。
　　骨折愈合是一个复杂而连续的生物学修复过程，受诸多因素的影响。血清ALP是成骨细胞分化的早期指标，是骨形成所必需的酶。ALP能分解有机磷酸化合物，促使无机磷酸盐离子与钙离子结合成磷酸钙而沉淀于骨组织内，成骨细胞分泌的ALP可以渗入血液，使血液ALP含量增加，ALP的活性常可提示骨折局部细胞增殖和活跃的程度，因此血清ALP可作为骨重建活跃性改变的标志，是一项观察骨折愈合的指标[10-11]。本实验GIOP造模期，模型组大鼠血清ALP与基础组比较显著降低，说明糖皮质激素可使大鼠血清中ALP活性显著下降，从而抑制成骨细胞的作用，并加强骨吸收，导致骨质疏松。在人为骨折4周后，为骨重建期和骨塑形期。本实验选择骨折术后经采用复骨方中药治疗4周时采血测定血清生化指标，以观察中药对骨折骨重建期骨代谢的影响，结果显示治疗组大鼠血清ALP活性明显高于模型组，由此可以推测，复骨方能提高骨折愈合重建时血清ALP的活性，增强骨折部位成骨细胞增殖，促进骨折愈合。复骨方由骨碎补、杜仲、续断、千年健、红花、归尾、川芎等组成，研究发现[12]，骨碎补可能通过提高血钙、磷的浓度，促进钙、磷沉积，增强机体内成骨细胞增殖活动，提高血清ALP的活性从而促进骨折愈合。
　　正常的骨代谢过程是通过消化道的吸收和排泌、肾脏的滤过和重吸收、骨骼的矿化和再吸收三方面的调节。钙盐在骨中沉积和骨中钙盐溶解的正常进行是维持血液中钙磷含量稳定的重要环节，血液中钙磷含量的高低又直接影响骨的钙化和溶解。糖皮质激素能够降低肠钙吸收，并抑制肾钙的再吸收，影响骨的矿化。赵亮等[13]研究发现，续断可提高骨折愈合中血清ALP的活性，升高钙磷沉积，促进骨形成。杜仲含有丰富胶原、磷、钙盐等微量元素，能激活骨折愈合过程中相关细胞释放更多的ALP，提高血清ALP的活性，有利于骨质修复[14]。具有补肾壮骨功效的中药复骨方能提高模型大鼠血钙水平，有助于新骨的形成或钙化，并促进骨重建和骨折愈合。
　　BGP来源于骨组织，由成骨细胞合成并分泌到骨中，是骨组织中非胶原性蛋白的主要成分，约占骨质蛋白的3%，其作用是调节和维持骨钙[15]。部分BGP沉积于骨基质，部分进入血液循环，因此，血清中BGP浓度可特异性地反映成骨细胞的活性[16]。本实验结果显示，实验8周末，模型组大鼠血清中BGP的含量比基础组显著降低，说明长期应用糖皮质激素造成大鼠成骨细胞的活性显著降低，抑制骨形成。骨折术后，经过4周治疗，治疗组大鼠血清中BGP的含量接近基础组，明显高于模型组，提示中药复骨方可以使成骨细胞的活性增强，促进成骨细胞合成和分泌BGP，促进骨折愈合。 　　综上所述，中药复骨方灌胃治疗可显著提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中药复骨方通过升高血Ca、P促进新骨的形成或钙化，提高骨折愈合重建时血清ALP的活性，增强骨折部位成骨细胞的活性，促进成骨细胞合成和分泌BGP，提高GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促进骨形成，有助于GIOP骨折的愈合。
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　　（收稿日期：2014-06-23 本文编辑：郭静娟）
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