HPLC与HPCE结合测定复方湿生扁蕾胶囊中6种化学成分含量

来源:用户上传      作者: 卢年华 赵慧巧 景明 刘娟娟 陈正君 陈晖

　　摘要：目的 建立HPLC与HPCE结合测定复方湿生扁蕾胶囊中木犀草素、当药黄素、当药醇苷及槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱含量的方法。方法 采用HPLC测定木犀草素、当药黄素、当药醇苷的含量，采用HPCE测定槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱的含量。结果 在确定的色谱条件下，复方湿生扁蕾胶囊中木犀草素、当药黄素、当药醇苷及槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱均被很好地分离。结论 本试验建立的HPLC与HPCE联合测定法准确可靠，可用于复方湿生扁蕾胶囊中木犀草素、当药黄素、当药醇苷、槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱的含量测定。
　　关键词：湿生扁蕾；苦豆子；含量测定；高效液相色谱法；高效毛细管电泳法
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.021
　　中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0086-05
　　Content Determination of 6 Chemical Constituents in Compound Shisheng Bianlei Capsules by HPLC and HPCE LU Nian-hua， ZHAO Hui-qiao， JING Ming， LIU Juan-juan， CHEN Zheng-jun， CHEN Hui （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）
　　Abstract： Objective To establish the method of HPLC and HPCE to determine the contents of luteolin， swertisin， swertianolin， sophordine， matrine and oxymatrine in compound Shisheng Bianlei Capsules. Methods HPLC was used to determine the contents of luteolin， swertisin， and swertianolin. HPCE was used to determine the contents of sophordine， matrine and oxymatrine. Results Under a certain chromatographic conditions， luteolin， swertisin， swertianolin， sophordinei， matrine and oxymatrine in the compound Shisheng Bianlei Capsules were well separated. Conclusion The establishment of HPLC and HPCE combined determination method is accurate and reliable， and can be used to content determination of luteolin， swertisin， swertianolin， sophordine， matrine and oxymatrine in compound Shisheng Bianlei Capsules.
　　Key words： Gentianopsis paludosa； Sophora alopecuroides； content determination； HPLC； HPCE
　　复方湿生扁蕾胶囊是由甘肃省名中医张银川主任医师的临床经验方研制而成的结肠靶向释药的口服固体制剂，由湿生扁蕾和苦豆子2味药组成，具有清热解毒、利湿止泻功效，主治大肠湿热所致的痢疾、肠炎等肠道疾病。在临床应用中，复方湿生扁蕾胶囊对慢性溃疡性结肠炎具有确切的疗效[1]。湿生扁蕾Gentianopsis paludosa（Munro）Ma.主要含有酮类、黄酮类和三萜类化合物，酮类和黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌等作用[2-4]。当药黄素是黄酮苷类化合物，对鼠伤寒杆菌具有中度抑制作用。当药醇苷为酮苷类化合物，具有抑制结核菌的作用[5]。木犀草素
　　基金项目：国家自然科学基金（81360522、81560717）
　　通讯作者：景明，E-mail：1339512509@qq.com
　　是黄酮类化合物，对番泻叶诱导的小鼠腹泻模型具有较好止泻作用[6]。苦豆子Sophora alopecuroides L.中富含生物碱、黄酮、有机酸、氨基酸、蛋白质、多糖、脂肪酸及无机元素等多种成分[7]。药理研究表明，苦豆子生物碱具有抗病毒、抗炎、抗变态反应、升高白细胞、抗癌等作用，对各种细菌、真菌及病毒都有较强的杀灭作用[8-11]。目前该制剂的质量标准中仅对湿生扁蕾所含木犀草素的含量进行测定，而苦豆子所含槐定碱等生物碱成分没有相应的含量测定方法，药品的内在质量不能得到有效控制。本试验以方中湿生扁蕾所含当药黄素、当药醇苷、木犀草素及苦豆子所含槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱为指标成分，分别建立基于高效液相色谱法（HPLC）和高效毛细管电泳法（HPCE）的定量测定方法，用以控制该制剂质量。
　　1 仪器与试药
　　Waters600高效液相色谱仪和Waters2487 PDA检测器（Waters公司），AE240电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），Beckman PACE/MDQ高效毛细管电泳仪和DAD检测器（Beckman公司），KQ-250B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
　　复方湿生扁蕾胶囊（甘肃中医药大学科研实验中心自制，规格0.3 g/粒，批号20140901、20141002、20141103）；对照品木犀草素（批号111520-200504，中国食品药品检定研究院，供含量测定用）、当药黄素（成都普菲德生物技术有限公司，批号140525，HPLC纯度>98%）、当药醇苷（成都普菲德生物技术有限公司，批号140521，HPLC纯度>98%）、槐定碱（国家标准物质研究中心，批号110784，供含量测定用）、苦参碱（国家标准物质研究中心，批号110805，供含量测定用）、氧化苦参碱（国家标准物质研究中心，批号110780，供含量测定用）；甲醇和乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。 　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　HPLC条件：色谱柱Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相为甲醇（A）和0.04%磷酸水溶液（B），0～20 min为甲醇∶水=40∶60～63∶37线性梯度洗脱，20～50 min为甲醇∶水=63∶37等度洗脱；流速0.8 mL/min；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样量20 ?L。
　　HPCE条件：毛细管柱68.5 cm×75 ?m；缓冲液50 mmol/L磷酸氢二钠，pH 5.5；电压25 kV；温度25 ℃；检测波长215 nm；压力进样0.5 psi，3 s；每次运行前，毛细管用0.1 mol/L NaOH溶液冲洗2 min、水冲洗2 min、运行缓冲液冲洗2 min；进样量10 ?L。
　　2.2 溶液的制备
　　2.2.1 对照品溶液制备 精密称取当药黄素、当药醇苷、木犀草素对照品21.28、23.54、46.44 mg，置于100 mL量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密吸取当药黄素、当药醇苷、木犀草素贮备液各5 mL，置250 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得当药黄素、当药醇苷、木犀草素的混合对照品溶液（含当药黄素4.256 ?g/mL、当药醇苷4.708 ?g/mL、木犀草素9.288 ?g/mL）。精密称取槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱对照品33.72、19.54、11.61 mg，置于100 mL量瓶中，分别加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。精密吸取槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱贮备液各5 mL，置250 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱的混合对照品溶液（含槐定碱6.744 ?g/mL、苦参碱3.908 ?g/mL、氧化苦参碱2.322 ?g/mL）。
　　2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取复方湿生扁蕾胶囊内容物0.5 g，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇10 mL，摇匀，称定质量，超声提取（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 ?m滤膜过滤，取续滤液作为HPLC测定供试品溶液。精密称取复方湿生扁蕾胶囊内容物1.0 g，置于具塞锥形瓶中，加体积分数65%乙醇60 mL，加入盐酸使提取溶剂pH=0.5，超声提取30 min（功率500 W，频率40 kHz），将提取液旋转蒸发至无醇浸膏，加40 mL水将浸膏完全溶解，加NaOH溶液使浸膏水溶液pH=10.5。将溶液置于120 mL分液漏斗，加入40 mL氯仿震荡，静置。萃取3次，合并氯仿溶液，减压浓缩至浸膏，用甲醇溶液溶解，定容于10 mL量瓶，摇匀，0.45 ?m滤膜过滤，取续滤液作为HPCE测定供试品溶液。
　　2.2.3 内标贮备液制备 精密称取氨茶碱对照品25.26 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得内标贮备液（含氨茶碱1.01 mg/mL）。
　　2.2.4 阴性对照溶液的制备 取缺湿生扁蕾阴性样品0.5 g，按照HPLC测定供试品溶液的制备方法制备缺湿生扁蕾的阴性对照溶液。取缺苦豆子阴性样品1.0 g，按照HPCE测定供试品溶液的制备方法制备缺苦豆子的阴性对照溶液。
　　2.3 系统适用性试验
　　精密吸取“2.2”项下当药黄素、当药醇苷、木犀草素混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20 ?L，注入液相色谱仪，按色谱条件进行分析，结果在与对照品峰保留时间一致的位置上，样品溶液的当药黄素、当药醇苷、木犀草素峰形良好，理论板数按木犀草素计算不低于3000，当药黄素、当药醇苷、木犀草素与相邻峰的分离度良好，阴性对照无干扰。色谱图见图1。
　　精密吸取“2.2”项下槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱的混合对照品溶液及内标贮备液各2 mL，混匀，作为对照品和内标的混合液；吸取供试品溶液及内标贮备液各2 mL，混匀，作为供试品和内标的混合液；吸取阴性对照溶液及内标贮备液各2 mL，混匀，作为阴性对照和内标的混合液。分别精密吸取上述3种混合液各10 ?L，注入毛细管电泳仪，按色谱条件进行分析，结果在与对照品峰保留时间一致的位置上，供试品溶液的槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱峰形良好，理论板数按槐定碱计算不低于3000，槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱与相邻峰的分离度良好，阴性对照无干扰。色谱图见图2。
　　A
　　B
　　C
　　注：A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；
　　1.当药黄素；2.当药醇苷；3.木犀草素
　　图1 复方湿生扁蕾胶囊中当药黄素、当药醇苷、木犀草素HPLC图
　　A
　　B
　　C
　　注：A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；
　　1.槐定碱；2.苦参碱；3.氧化苦参碱；4.氨茶碱
　　图2 复方湿生扁蕾胶囊中槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱、氨茶碱HPCE图
　　2.4 线性关系考察
　　精密吸取“2.2.1”项下当药黄素、当药醇苷、木犀草素对照品贮备液各1 mL，分别置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密吸取2、6、10、15、20 ?L，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰。精密吸取“2.2.1”项下槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱对照品贮备液各1 mL，分别置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密吸取2、4、6、8、10 ?L，注入高效电泳仪测定。分别以峰面积值对质量（ng）进行线性回归分析，结果见表1、表2。
　　2.5 精密度试验
　　按“2.2.1”项下操作，精密吸取当药黄素、当药醇苷、木犀草素混合对照品溶液20 ?L，重复进样5次，测得当药黄素峰面积RSD=0.82%、当药醇苷峰面积RSD=0.80%、木犀草素峰面积RSD=0.73%。结果表明精密度良好。 　　按“2.2.1”项下操作，精密吸取槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱混合对照品溶液10 ?L，重复进样5次，测得槐定碱峰面积RSD=0.93%、苦参碱峰面积RSD=0.87%、氧化苦参碱峰面积RSD=0.98%。结果表明精密度良好。
　　2.6 重复性试验
　　取同一批样品（批号20140901），精密称取内容物6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在高效液相色谱仪进样20 ?L，记录峰面积，计算质量分数。结果当药黄素的平均质量分数为35.2 ?g/g，RSD=1.33%；当药醇苷平均质量分数为18.3 ?g/g，RSD=2.01%；木犀草素平均质量分数为65.1 ?g/g，RSD=1.67%。表明重复性良好。
　　取同一批样品（批号20140901），精密称取内容物6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在高效电泳仪进样10 ?L，记录峰面积，计算质量分数。结果槐定碱的平均质量分数为92.8 ?g/g，RSD=1.42%；苦参碱平均质量分数为52.8 ?g/g，RSD=1.97%；氧化苦参碱平均质量分数为23.2 ?g/g，RSD=1.83%。表明重复性良好。
　　2.7 稳定性试验
　　取供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h在高效液相色谱仪进样20 ?L，记录色谱图中当药黄素、当药醇苷、木犀草素的峰面积，计算其RSD分别为0.49%、0.51%、0.47%，表明供试品溶液在24 h内稳定，满足测定要求。
　　取供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h在高效电泳仪进样10 ?L，记录色谱图中槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱的峰面积，计算其RSD分别为0.53%、0.66%、0.71%，表明供试品溶液在24 h内稳定，满足测定要求。
　　2.8 加样回收率试验
　　精密称取已测定当药黄素、当药醇苷、木犀草素量的样品（批号20140901）约0.25 g，共5份，分别加入当药黄素、当药醇苷、木犀草素对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并注入高效液相色谱仪进行测定分析，计算回收率，结果平均回收率分别为97.81%、97.51%、98.22%，见表3。
　　精密称取已测定苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱量的样品（批号20140901）约0.5 g，共5份，分别加入苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并注入高效电泳仪进行测定分析，计算回收率，结果平均回收率分别为96.74%、96.67%、95.87%，见表4。
　　2.9 样品测定
　　取3批次样品，按上述制备和测定方法进样测定，每份平行测定3次，按标准曲线法分别计算当药黄素、当药醇苷、木犀草素、苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的质量分数。结果见表5、表6。
　　3 讨论
　　本研究采用HPLC测定复方湿生扁蕾胶囊中当药黄素、当药醇苷、木犀草素的含量，同时采用HPCE测定复方湿生扁蕾胶囊中槐定碱、苦参碱和氧化苦参碱的含量。赵氏等[12]采用HPLC对湿生扁蕾与苦豆子配伍提取物中当药黄素、当药醇苷、木犀草素的测定方法进行了考察，对检测波长、流动相及洗脱方式进行了优选，为复方湿生扁蕾胶囊质量控制提供了可行的方法。有关苦豆子中生物碱的含量测定方法，已报道的主要有紫外吸收法（UC）、薄层色谱法（TLC）、HPLC、HPCE等方法。UC适宜测定总生物碱，且对样品的纯度要求较高；TLC虽然简便，但重现性差，影响因素多；采用HPLC分析时，由于苦豆子中生物碱成分的碱性强、极性大，色谱柱吸附太强，色谱峰拖尾严重，另外200 nm左右的近紫外吸收也造成杂质成分太多而难以分离；而采用HPCE分析，不但分离效率高，还可有效消除溶剂及杂质的干扰，峰形对称尖锐。
　　本研究结果表明，采用HPLC测定复方湿生扁蕾胶囊中当药黄素、当药醇苷、木犀草素，同时采用HPCE测定复方湿生扁蕾胶囊中苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的含量，方法简便、准确、重复性好，能够为该制剂的质量控制提供方法学基础。
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　　（收稿日期：2015-12-10）
　　（修回日期：2015-12-22；编辑：陈静）
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