槐米多糖的提取和纯化工艺研究

来源:用户上传      作者: 周颖 夏新奎

　　摘要：为探讨中药槐米中可溶性粗多糖的提取工艺，通过单因素试验和Ｌ９（３３）正交试验，研究了提取温度、料水质量比、提取时间对多糖提取率的影响。结果显示，３个因素对多糖提取率的影响顺序为提取时间、料液比、提取温度，最佳提取工艺为提取温度９０ ℃，料水质量比１∶１５，提取时间９０ ｍｉｎ，所得槐米粗多糖的提取率为５．１０％。对槐米粗多糖脱蛋白方法的研究显示木瓜蛋白酶＋Ｓｅｖａｇ法脱蛋白处理效果优于Ｓｅｖａｇ法和３％三氯乙酸法。
　　关键词：槐米多糖；提取工艺；正交试验
　　中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）15－3161-03
　　
　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉng Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ
　　
　　ＺＨＯＵ Ｙｉｎｇ，ＸＩＡ Ｘｉｎ－ｋｕｉ
　　（Ｘｉｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｘｉｎｙａｎｇ ４６４０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
　　
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ of Ｌ９（３３） ｗere ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｒａｔｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｉｍｅ ｈａｄ ｔｈｅ ｇｒｅａｔｅｓｔ ｉｍｐａｃｔ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｗｈｉｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｈａｄ ｔｈｅ ｌｅａｓｔ ｉｍｐａｃｔ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ９０ ℃， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ １∶１５（m/V，g∶mL）； ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｉｍｅ ９０ ｍｉｎ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉng ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ ｗａｓ ５．１０％． Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍ ｃｒｕｄｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ｓｅｖａｇ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ papain ｗａｓ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ Ｓｅｖａｇ ｍｅｔｈｏｄ ａｌｏｎｅ ｏｒ ３％ ＴＣＡ ｍｅｔｈｏｄ．
　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉng ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； orthogonal design
　　多糖作为参与生命活动的基本物质之一，常是细胞表面信号识别、抗原抗体反应、细胞间信息的传递和感受的关键因子，在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面均起到一定的作用。多糖种类繁多，广泛存在于动物、植物、微生物中。为充分开发多糖资源，近年来我国对植物多糖，特别是具有中国特色的中草药多糖的药物活性进行了广泛研究。槐米（Ｆｌｏｓ Ｓｏｐｈｏｒａｅ Ｉｍｍａｔｕｒｕｓ）别名白槐、柚花、槐蕊，为豆科植物槐（Ｓｏｐｈｏｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌ．）的花蕾或花朵，性微寒，味苦［１］。近代医学研究证明，槐米具有一定的抑菌、抗癌、保健等药理作用，其主要成分芦丁具有抗菌消炎，防止血管破裂和止血作用，对紫外线具有极强的吸收作用，而且具有很好的抗氧化作用［２，３］。但对槐米多糖的研究还鲜见报道。以槐米粗多糖的提取率为考察指标，采用单因素试验和Ｌ９（３３）正交试验对提取过程中温度、料液比、提取时间３因素进行了优化；对粗多糖的脱蛋白方法进行了选择，旨在为槐米多糖的开发利用提供参考。
　　１材料和方法
　　１．１材料和仪器
　　１．１．１材料槐米购自信阳市药材公司，产地为河南，经信阳农业高等专科学校药用植物教研室鉴定为中药槐米。
　　１．１．２试剂甲醇、乙醇、丙酮、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇、三氯乙酸、木瓜蛋白酶均为国产分析纯。Ｓｅｖａｇ试剂：氯仿与正丁醇体积比为５∶１。
　　１．１．３主要仪器电热恒温水浴槽，北京市医疗设备厂；Ｚ３２３Ｋ高速冷冻离心机，德国ＨＥＲＭＬ公司；７５２紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。
　　１．２试验方法
　　１．２．１槐米粗多糖的提取称取粉碎的槐米干品粉末２００ ｇ，甲醇回流脱去表面脂肪，抽滤，药渣风干。再用８０％乙醇回流除去小分子糖、苷类、生物碱等，药渣风干。然后分别取药渣５ ｇ，以水作为溶剂，采用不同的提取温度、料水质量比、提取时间对药渣提取多糖。水提液离心除去杂质，减压浓缩至小体积，加无水乙醇至浓度为７５％，沉淀；静置２４ ｈ后过滤，用９５％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次，真空干燥，得槐米粗多糖。按下列公式计算粗多糖提取率：
　　１）单因素试验。分别考察提取温度、料水质量比及提取时间对提取率的影响。①提取温度：分别在５０、６０、７０、８０、９０ ℃温度下，料水质量比为１∶１２，提取４５ ｍｉｎ。②料液比：固定提取温度为８０ ℃，提取时间４５ ｍｉｎ，分别以１∶８、１∶１０、１∶１２、１∶１５、１∶１８的料水质量比进行提取试验。③提取时间：固定提取温度８０ ℃，料水质量比１∶１２，分别以３０、４５、６０、９０、１２０ ｍｉｎ提取槐米粗多糖。
　　２）正交试验。选取提取温度、料水质量比、提取时间３个因素，参照单因素试验，各设置３个水平进行正交试验，因素及水平见表１。
　　１．２．２粗多糖的纯化
　　１）指标测定。①蛋白质含量：利用紫外吸收法测定粗多糖中蛋白质的含量［４］。配制多糖粗品溶液，以水作为空白对照，分别于２８０ ｎｍ和２６０ ｎｍ测吸光度值，根据经验公式：蛋白质浓度Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）＝１．４５×Ａ２８０nm－０．７４×Ａ２６０nm即可求得样品溶液中蛋白质的浓度。②多糖含量：采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量［５］。
　　２）脱蛋白处理。分别采用３种方法对粗多糖进行脱蛋白处理。①Ｓｅｖａｇ法［６］：根据蛋白质在氯仿等溶剂中变性的特点，加入多糖溶液１／５体积的Ｓｅｖａｇ溶液，混合后剧烈振荡２０ ｍｉｎ，离心除去变性蛋白质沉淀，重复５次，再浓缩、醇沉、洗涤、真空干燥。②３％三氯乙酸法［６］：在多糖溶液中滴加３％三氯乙酸，直至溶液不再浑浊，５～１０ ℃放置过夜，离心除去胶状蛋白，再浓缩、醇沉、洗涤、真空干燥。③木瓜蛋白酶＋Ｓｅｖａｇ法：将木瓜蛋白酶按蛋白酶、多糖质量比１∶２０加入多糖溶液中，于７０ ℃在恒温磁力搅拌器中保温５ ｈ，再按①的方法加入Ｓｅｖａｇ溶液，重复３次，再浓缩、醇沉、洗涤，真空干燥。将３种方法获得的脱蛋白粗多糖分别配成０．０５ ｍｇ／ｍＬ的样品液，测定蛋白质及多糖含量。

　　２结果与分析
　　２．１提取工艺优化结果
　　２．１．１温度对提取率的影响温度过低，不利于多糖物质的溶出；而温度过高，容易引起多糖降解，反而不利于多糖的提取。由图１可以看出，提取率先随温度升高缓慢升高，到７０ ℃时升高速度较快，８０～９０ ℃为较理想的提取温度。
　　２．１．２料水质量比对提取率的影响一般来说，只要能将活性物质溶出，料水质量比越大越好，因为料水质量比过小会给以后的浓缩带来不便。从图２看出，提取率随料水质量比的减小先呈上升趋势，至１∶１５时达到最大，之后随料水质量比的减小而下降。
　　２．１．３时间对提取率的影响延长提取时间会提高提取率，但当细胞中的有效成分已完全溶出时，再延长提取时间不但不能提高提取率，反而会增加提取液中杂质的含量。由图３看出，提取率先随时间的延长而增加，到６０ ｍｉｎ时提取率达到最大，此后再延长提取时间，提取率反而下降。
　　２．１．４正交试验结果由表２可见，不同因素水平对提取率有明显的影响，其中提取时间对提取率影响最大，提取温度的影响最小。以提取率为目标，则最佳提取方案为Ａ３Ｂ３Ｃ３，即提取温度９０ ℃，料水质量比１∶１5，提取时间９０ ｍｉｎ。由于最优提取工艺没有包含在正交试验内，进行了验证试验。在最佳条件下提取槐米粗多糖，所得提取率为５．１０％，高于其他试验组合。
　　２．２脱蛋白方法优化结果
　　蛋白质是粗多糖中的主要杂质，它们所带电荷可吸附大量其他杂质，使其他杂质的去除变得困难，而且还会吸附多糖，增加了多糖分离的难度。所以要获得纯度较高的多糖，就必须进行脱蛋白处理。由表３可知，①Ｓｅｖａｇ法对蛋白质的去除率达９４．１１％，但同时多糖损失达５３．６４％，此法对于蛋白质结合多糖的处理较为困难，容易一起絮凝沉淀，造成样品多糖的损失，且需要多次重复，耗时较长。②三氯乙酸法对于蛋白质的去除率也较高，但同样多糖的损失率大，达６９．８８％，且此法较为剧烈，容易引起某些多糖的降解。③木瓜蛋白酶＋Ｓｅｖａｇ法利用木瓜蛋白酶切断蛋白链，水解了大部分结合蛋白和游离蛋白，有利于多糖物质的溶出，同时也降低了多糖溶液的黏稠度，再配以Ｓｅｖａｇ法，不仅脱蛋白效率高，达９９．２１％，且多糖的损失大大降低，有利于真空浓缩和槐米多糖的进一步纯化，优于其他两种提取方法。
　　３结论
　　为了优化槐米多糖的提取方法，研究了槐米多糖的提取工艺及３种脱蛋白方法，得出如下结论：
　　１）以水为溶剂进行提取，控制水浴温度为９０ ℃，料水质量比为1∶15，提取时间９０ ｍｉｎ，提取３次，即可得到较高的提取率。
　　２）脱蛋白过程中，与酶结合Ｓｅｖａｇ法相比，从蛋白质的脱除率和多糖的损失率来看，两种化学法（Ｓｅｖａｇ法和３％三氯乙酸法）脱蛋白效率均不如酶结合Ｓｅｖａｇ法，酶结合Ｓｅｖａｇ法操作简便、高效、毒性小，是理想的脱蛋白方法。
　　参考文献：
　　［１］ 丁宝章，王遂义，高增义． 河南植物志（第一册）［Ｍ］． 郑州：河南科学技术出版社，１９８８．
　　［２］ 中国药材公司． 中国中药资源志要［Ｍ］． 北京：科学出版社，１９９４．
　　［３］ 黄海兰，李俊，徐波． 槐米抗食用油脂氧化活性及其成分研究［Ｊ］． 食品科学，２００７，２８（８）：８６－８９．
　　［４］ 马如复． 生物化学实验［Ｍ］． 武汉：武汉大学出版社，１９９８．
　　［５］ 李俊，韩向晖，李仲洪，等． 茯苓多糖的提取及含量测定［Ｊ］． 中国现代应用药学，２０００，１７（１）：４９－５０．
　　［６］ 方积年． 多糖的分离纯化及其纯度鉴别与分子量测定［Ｊ］． 药学通报，１９８４，１９（１０）：４６－４９．

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