人参锈腐病拮抗细菌的筛选与鉴定

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　　摘要：从靖宇县和长白山两地土壤中分离出500 株细菌，从中筛选出20株对人参锈腐病菌（Cylindrocarpon destructans）具有明显抑制作用的拮抗菌株。选择抑菌效果最好的菌株CB206，对几种常见病原菌进行抑菌谱试验。结果表明：菌株和其发酵液对镰刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻纹枯、玉米纹枯均有较好的抑菌效果。通过对其形态特征及16S rDNA序列分析研究，确定其为沙雷菌属。
　　关键词：人参锈腐病；拮抗细菌；筛选；鉴定
　　中图分类号： S435.675 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.16.019
　　人参锈腐病作为对人参的主要病害之一，感染后参根出现不同程度的红褐色腐烂斑[1]。长期以来人们一直依靠化学农药对人参土传病害进行防治，但并没从根本上解决问题，利用有益微生物来对其进行防治，是具有无毒、无污害的一条有效途径[2]。本研究从靖宇县、长白山两地土壤中分离细菌，并对其中抗人参锈腐病的菌株进行筛选与鉴定，期望得到具有商业价值的拮抗菌株。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试菌株和培养基
　　人参锈腐病、镰刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻纹枯、玉米纹枯。供试培养基为NA，PDA和BY培养基。
　　1.2人参土壤拮抗细菌的分离
　　取自靖宇县和长白山土壤共85份。取各土样5克，分别加入装有50毫升无菌水的三角瓶中，摇床振荡30分钟，然后进行梯度稀释。吸取稀释液 100μL，放入事先准备好的NA 平板上均匀涂布，每个处理3次重复。稀释度以每平板菌落数100～150为宜，于28℃下培养24小时。调取不同类型的菌落于 NA 平板上纯化3次后 ，4 ℃ 保存于NA斜面上备用。
　　1.3 菌株及发酵液的拮抗活性测定
　　以人参锈腐病为指示菌进行拮抗活性测定。将病原菌放置PDA中央，将细菌划线到四周，观察有无抑菌圈出现，筛选优良拮抗菌株。
　　将上述具有拮抗性的菌株转接至新鲜的斜面培养基上，28 ℃ 条件下培养1天后，接种至装液50毫升的250毫升三角瓶内，在28℃、转速为200转/分钟的旋转式摇床上振荡培养48小时，得发酵液。
　　发酵液经离心后与菌体分离，分别用乙酸乙酯和甲醇进行抽提，旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液加入到滤纸片中，进行对峙培养，观察有无抑菌效果。
　　1.4 拮抗细菌的抑菌谱测定
　　对抑菌圈明显、拮抗效果好的菌株进行抑菌谱测定，供试病原菌包括镰刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻纹枯、玉米纹枯。方法同本文“1.3”。
　　1.5 16S rDNA基因序列测定
　　细菌总DNA提取用CTAB NaCl。PCR扩增采用通用引物27F，1492R。
　　PCR反应体系（20μL）扩增体系：10×扩增缓冲液（不含MgCl2）2.0μ L，MgCl21.0μL，dNTP （ 10 mmol/ L ） 1 μL，P1、P2（10μmol/ L）各1.0μ L，Taq 酶（215 U/μL） 0.5μL，DNA 1.0μL ，补加超纯水至20μL。PCR程序：95 ℃预变性5分钟 ；94 ℃变性60秒，56 ℃退火30秒，72 ℃延伸1.5分钟，循环33 次，72 ℃最终延伸10分钟。代表菌株的PCR产物测序由上海生工公司完成。测序结果用NCBI数据库中的BLAST进行相似性分析，找到与其同源性较高的菌株。
　　2 结果与分析
　　2.1土壤拮抗细菌的分离
　　从两地共分离出500株细菌，其中350株来源于长白山，150株来源于靖宇县。
　　2.2土壤细菌拮抗活性的测定结果
　　对采自不同地区、不同地块的85份土样中分离得到的 500 株细菌进行室内抗菌活性测定。经过初筛、复筛，发现有10株菌株对人参锈腐病有明显拮抗作用。其中菌株CB206 对人参锈腐病菌的抑菌效果最好。
　　2.3拮抗菌株CB206的抑菌谱测定
　　将菌株CB206与镰刀菌、柑橘炭疽、甘薯黑斑、水稻稻瘟、水稻纹枯、玉米纹枯进行抑菌圈对峙培养试验。CB206对几种病原菌都要较好的拮抗效果，说明其有很好的光谱抗菌性，有较好的研究开发价值。
　　2.4拮抗细菌BS015的16S rDNA序列测定
　　以细菌的基因组DNA为模板，经过PCR扩增后，得到1条约1500 bp 的DNA 片段。将其测序，经过在NCBI数据库中进行Blast相似性分析得其属于沙雷菌属。
　　3 结论与讨论
　　本实验从不同地区共筛选到20株有拮抗作用的细菌。对拮抗效果最好的菌株CB206进行16SrDNA基因序列和生理生化试验，结果表明该菌株属于沙雷菌属。
　　本实验筛选出的菌株CB206对人参锈腐病菌具有明显的抑制作用，在抑菌谱试验中发现CB206具有光谱抗菌性，可能是多种生防机制共同作用，例如产生抗生素、竞争、溶菌以及促生和诱导抗性等协同作用的结果。对于活性物质的筛选，盆栽试验，安全性等问题，有待于进一步的研究。
　　参考文献
　　[1] 赫荣琳，李玉，等.人参锈腐病接抗菌的筛选及鉴定[D].吉林农业大学，2006.
　　[2] 吴连举，杨依军，武侠，等.利用土壤拮抗微生物防治人参锈腐病[J].中国生物防治，1999，15（04）：166-168.
　　作者简介：任飞娥，硕士，陕西省榆林农业学校，助理讲师，研究方向：植物保护。
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