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柑橘黄龙病分子生物学检测方法研究进展

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  摘要 柑橘黄龙病是世界范围内极具破坏性的危险性病害,可防可控但不可治,加强黄龙病早期诊断,探索快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测技术对防止该病害的传播蔓延具有极其重要的意义。综述了国内外关于柑橘黄龙病分子生物学检测诊断方面的研究进展,介绍了该领域各检测方法的特点和存在问题,主要介绍了PCR检测技术,提出了大批量黄龙病样品检测适宜选用巢式PCR检测方法。
  关键词 柑橘黄龙病;分子生物学;检测方法;研究进展
  中图分类号 S432 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2016)12-130-02
  Abstract Citrus Huanglongbing is a devastating disease in the world,which is preventable and controllable but incurable. In order to prevent the spread,it is extremely important to strengthen early diagnosis,explore the fast,accurate,high sensitivity and specificity methods. Recent advances in molecular detection technique of Cirus Huanglongbing,as well as the features and existing problems of different methods in this paper were summarized,and the focus was on the PCR detection technique. Using the Nested-PCR to detect numerous samples had been proposed.
  Key words Citrus Huanglongbing;molecular;detection technique;reseach progress
  柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing)是一种世界性的毁灭性病害,主要发生于东南亚和非洲的40多个国家,严重阻碍了这些国家和地区柑橘产业的生产和发展。20世纪60年代初,柑橘黄龙病在我国只分布在广东、广西、福建和台湾4个省,但到80年代已扩展蔓延到长江流域以南的11个省区[1]。柑橘黄龙病在目前缺乏有效防控药剂和抗病品种的条件下,加强病害的早期检测对病害的防控具有重要的现实意义。长期以来,斑驳状黄化叶片和“红鼻子”果常作为柑橘黄龙病的典型症状诊断依据,但易与柑橘缺肥、缺素等症状混淆,而黄龙病菌入侵到典型症状有一段潜伏期,未显症但已带菌柑橘可作为田间病害再侵染源造成病害扩展。
  柑橘黄龙病迅速蔓延的主要原因之一就是在生产上缺乏一套规范有效的检测柑橘黄龙病病原的方法,生产和植检部门无法及早地控制带病苗木的传播,使得病害不断扩展。20世纪90年代以后,随着分子生物学方法的发展,准确灵敏的分子方法已广泛应用于黄龙病的检测,报道的主要有核酸探针检测、PCR检测技术和环介导恒温技术方法,最广泛用于黄龙病菌检测的是PCR方法[2-3]。关于柑橘黄龙病研究概况,前人已有不少综述,本文则主要对其分子生物学检测方法研究进展作简单综述,为今后开展进一步研究当作参考。
  1 核酸探针检测
  分子杂交检测技术是根据病原序列制备标记探针,与待测样品单链DNA在一定的条件下按碱基互补原成双链,通过标记探针放射自显影或尼龙膜显影来检测病原。20世纪90年代,国外学者先后对来自亚洲和非洲的黄龙病病原设计出了32P标记的In-2.6和As-1.7探针,通过与来自亚洲和非洲黄龙病菌DNA分子杂交试验发现,二者对所有黄龙病亚洲株系检测结果均为阳性,但In-2.6对非洲种特异性差,在不严格洗脱下,仍可检测到微弱的杂交信号[4-5]。Korsten等[6]同时运用上述2种探针检测南非地区黄龙病,结果显示In-2.6的检测结果均为阴性,而As-1.7的检测结果均为阳性,说明该方法特异性较高。Hung等[7]克隆了台湾黄龙病菌的一个DNA片段,并用生物素标记设计获得探针,可特异检测多地亚洲种黄龙病菌株系,对南非种无识别反应。Hocquellet等随机设计了102条引物,对感病与健康材料柑橘总DNA进行扩增,利用RAPD技术共筛选到8对引物,克隆获得的特异性片段P3I与来自中国福州、台湾、印度、泰国、菲律宾等地的亚洲种株系进行Southern杂交,结果发现其与泰国菌株相似性最低,而与印度Poona菌株相似性最高[8]。
  分子杂交技术用于病害检测是可行的,但此过程中探针制备和杂交反应条件比较复杂,且病原菌DNA用量大、探针的同位素标记对人有害、反应自动化程度低等因素限制了该技术的广泛应用,目前实验室很少应用。
  2 环介导恒温技术
  LAMP是一种区别于传统PCR扩增DNA目的片段方法。该技术利用病原物的已知序列中的6个特异性保守区域(3′端的F3c,F2c,Flc区及5′端的B1,B2,B3区)设计了2对引物,在等温条件进行扩增反应,基因的扩增和产物的检测可一步完成,避免了PCR温度循环的特殊要求。反应结束后,依据扩增产物中产生白色沉淀物焦磷酸镁;或是反应体系中加入SYBR Green I后,在紫外灯或日光下通过肉眼观察扩增产物颜色即可判断,无需电泳。目前,该技术已广泛用于植物病毒、细菌、真菌性病害及转基因作物的检验检疫工作中,具有很好的应用前景。Okuda等[9]以柑橘黄龙病菌亚洲种的nusG-rplKAH-rpoB基因簇区设计2对引物,首次建立了柑橘黄龙病LAMP检测方法,结果显示其检测灵敏度与常规PCR―致。国内黄丽[10]依据NCBI上公布的亚洲种omp外膜蛋白基因保守序列,设计了omp-F3/omp-B3与omp-FIP/omp-BIP 2对引物,通过反应试验组分优化,构建了柑橘黄龙病的LAMP检测技术体系,其检测灵敏度比一般的常规PCR高100倍,基本与实时荧光定量PCR检测效率相当。   然而,LAMP技术也存在一些不足之处。引物设计要求较高,预期扩增靶标序列片段长度不得超过300 bp,特异性引物对的筛选过于复杂。此外,该反应扩增结果只有扩增与否2种情况,若发生非特异性扩增,结果不易区分鉴别;灵敏度过高,反应体系的配制要求苛刻。
  3 PCR检测技术
  PCR实质是特异性片段的体外酶促合成反应。通过已公布的黄龙病菌核酸序列,设计特异性引物对,体外离体对目的片段进行克隆,产物凝胶电泳即可对样品是否感染黄龙病进行有效判断。该技术具有灵敏、简便、特异、高效等特点,已成为实验室检测常用方法。目前,关于柑橘黄龙病PCR检测技术包含常规PCR、Nested-PCR及实时荧光定量PCR等。
  Jagoueix等[11]利用细菌通用引物扩增黄龙病菌的16S rDNA序列,并依据该序列设计特异性引物OI1/OI2c,特异性片段大小为1 160 bp,经限制性内切酶Xba I酶切后,根据酶切产物可区分亚洲种和非洲种。Hocquellet等[12]根据黄龙病菌β-操纵子核蛋白基因(rplKAJL-rpoB基因簇)设计引物A2/J5,亚洲种目标片段长度为703 bp,非洲种目标片段长度为669 bp。Teixeira等[13]发现使用已有的引物OI1/OI2c无法阳性检测出现在巴西圣保罗地区疑似黄龙病症状的材料,重新设计了针对黄龙病美洲种的16S rDNA序列的引物对GB1/GB3,该引物对可特异检测到黄龙病美洲种,目标片段大小为1 120 bp。在国内,田亚南等[14]根据黄龙病菌亚洲种rplKAJL-rpoB部分序列设计引物对OL1/OL2,可检测中国和泰国黄龙病菌。唐娅媛[15]采用PCR检测技术对湖南逾20个县(市)的疑似柑橘黄龙病园区进行病害调查,建立了针对湖南地区感病柑橘和带菌木虱的PCR检测方法。常规PCR对显症植株有很好的鉴定效果,但植株带菌却不显症或是病原在植株体内分布不均匀,均会使得常规PCR检测会出现一定的假阳性,因此需要更加灵敏的PCR检测技术[16]。
  荧光定量PCR检测方法在常规PCR方法的优点基础上还能通过计算机系统直接探测PCR扩增过程中利用荧光信号积累,实时监控PCR反应过程,定量检出菌原浓度。廖晓兰等[17]使用实时荧光PCR技术检测HLB病原菌,选取黄龙病16S rDNA基因序列中与其他细菌的变异位点设计荧光探针,建立了黄龙病原的实时荧光PCR检测方法,结果显示该方法比常规PCR检测更高效特异,且无需进行PCR反应后的有毒电泳,可以快速动态地检测PCR扩增产物并减少外来核酸造成的污染。胡 浩等[18]选择亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因设计筛选的特异性引物对和探针,构建了特异检测黄龙病菌的荧光定量PCR的检测体系,其检测灵敏度至少可以达到4.39 fg/μL。Tatineni等[19]和Li等[20]分别采用该方法分析了病原菌在感病植株内分布情况:病树叶中脉和叶柄病菌含量最高,树皮次之,树根最低,大致按至上而下逐渐降低;而在果实中橘络、果柄病菌含量最高,中柱次之,果皮最低。张 培等[2]利用实时定量PCR检测技术研究了砂糖橘红鼻子果与韧皮部杆菌侵染相关性问题,结果表明砂糖橘携带病原浓度从大到小的部位依次为“红鼻子”果、斑驳叶片、均匀黄化叶片、无症状果实,各类型材料中病原浓度差别较大,其中田间“红鼻子”果阳性检出率为100%,可作为田间黄龙病诊断的可靠依据。
  Nested-PCR技术是一种变异的PCR反应,共分为2轮反应。第1对PCR引物扩增片段和常规PCR相似,第2对引物称为巢式引物,结合在第1次PCR产物内部进行短片段的合成反应。其优势在于,如果第1次扩增产生了错误片断,则第2次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,Nested-PCR的扩增非常特异。Harakava等[21]首先运用Nested-PCR技术检测亚洲种和非洲种,发现Nested-PCR不仅增加了特异性扩增,提高了扩增效率,也提高了检测的灵敏度,这些比常规PCR更为效率。在国内,李 韬等[22]比较常规PCR和Nested-PCR对柑橘木虱及九里香黄龙病检测方面,发现常规PCR检测下限是2头带菌木虱,而Nested-PCR可检测到单头带菌木虱;丁 芳等对比巢式PCR和常规PCR检测感染HLB的不同品种柑橘植株试验表明,Nested-PCR可更早检测到接毒植株中的HLB病原,灵敏度比常规PCR检测更高[23]。比较常规PCR与Nested-PCR 2种检测方法得出[24],两者均能在较低模板浓度下对柑橘黄龙病进行准确检测,但常规PCR检测时所需DNA聚合酶要求较高,且反应模板和参数设置条件相对严格,这在一定程度上限制了田间实际生产过程中不同类型材料的大批样品快速检测;而Nested-PCR检测法反应组分配比和酶要求不高,且成本核算较为低廉,灵敏度亦能达到黄龙病的检测要求。
  4 结语
  柑橘黄龙病是世界范围内极具破坏性的危险性病害,可防可控但不可治,加强黄龙病早期诊断,探索快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测技术对防止该病害的传播蔓延具有极其重要的意义。虽然田间柑橘黄龙病的症状和指示植物诊断方法简易直观,但田间黄龙病柑橘植株症状复杂,易与缺素、水害等因素造成的黄化症状混淆,因此耗时较长,不适合大规模检测。常规检测方法如电镜诊断、生理生化指标测定及光谱检测技术虽能准确检测出黄龙病病菌,但检测对象大多已发病显症,而对带菌而未显症状黄龙病检测的灵敏度和准确性较差。从理论上讲,PCR技术可以检测到单拷贝的目的基因,灵敏度较高,即只要植株携带病原菌即可检测确诊。
  PCR检测技术是使用数据库中公布的黄龙病菌核酸序列,设计特异性引物,体外离体对目的片段的高效合成,反应完成后,取PCR产物凝胶电泳即可对样品是否感染黄龙病进行判断。该技术具有灵敏、简便、特异、高效特点,已成为实验室检测常用方法。   普通PCR得益于其较低的成本,适合用于田间初次普查;实时荧光定量PCR非常适合对普通PCR没有检出的疑似样品进行进一步的确认,或可对黄龙病菌侵染早期,含菌量较低的样本,如种苗、接穗进行定量检测;巢式PCR同时具有前两者的一些优点,并且检测下限即灵敏度与前两者
  差异不大,准确性能基本相当,考虑到田间黄龙病大批量的样品检测成本,选用巢式PCR检测方法最佳。
  5 参考文献
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