丹参根部颜色及其与活性成分含量的相关性研究

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　　摘要：采用HPLC法测定丹参根部水溶性（迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B）和脂溶性（二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA）活性成分含量，并用色差仪测根部颜色，探讨丹参根部颜色与其活性成分含量间的相关性，为制定丹参药材等级标准提供依据。结果表明：不同颜色级别丹参表面色度值存在明显差异，可据此对其进行等级划分；多数活性成分含量存在显著差异；二氢丹参酮Ⅰ和紫草酸与色度值L*、a*、b* 相关性不显著（P>0.05），其他5种成分与色度值L*均呈负相关，与a* 、b* 均呈正相关，其中迷迭香酸、丹酚酸B及丹参酮Ⅰ与色度L*值呈极显著负相关（P<0.01），隐丹参酮、丹参酮ⅡA与a*值和b*值呈现极显著正相关（P<0.01）。由此可见，丹参根部越红活性成分含量越高，这为合理评价丹参药材质量、进行丹参药材分级提供了理论依据。
　　关键词：丹参；颜色；活性成分；相关性
　　中图分类号：S567.5+30.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）08-0059-04
　　Abstract The HPLC method was applied to determine the contents of water-soluble ingredients （rosmarinic acid， lithospermic acid， Salvianolic B） and fat-soluble ingredients （DihydrotanshinoneⅠ， cryptotanshinone， tanshinoneⅠ and tanshinone ⅡA）. The color of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE was measured by colorimeter. The correlation between them was analyzed to provide references for setting grade standard of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE. The results showed that the chromatic value of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE surface was different between different grades，so grading could conduct based on this；and the content of each ingredient was obviously different between different colour grades. Except DihydrotanshinoneⅠand lithospermic acid had no significant correlations with the chromatic value L*， a* and b* （P>0.05）， the other ingredients all showed negative correlations with L* but positive correlations with a* and b*. Among them， rosmarinic acid， Salvianolic B and tanshinoneⅠ showed very significantly negative correlations with L* （P<0.01）， while cryptotanshinone and tanshinone ⅡA showed very significantly positive correlations with a* and b* （P<0.01）. Thus， the redder the RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE was，the higher the contents of active ingredients were， which could provide theoretical references for reasonable quality evaluation and grading of RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE.
　　Key words RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE； Colour； Active ingredients； Correlation
　　丹参药材为唇形科多年生草本植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根茎，属于临床常用大宗药材，具有活血祛瘀、调经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效[1]。其活性成分主要包括脂溶性的二萜醌类和水溶性的酚酸类，前者有隐丹参酮、丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ、丹参新酮等，以丹参酮ⅡA为主；后者有丹参素、原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、紫草酸及丹酚酸A、B、C、D、E、F等，以丹酚酸B为主[2]。现代药理研究表明，丹参具有抗氧化、抗肿瘤、抑制肝细胞凋亡、抗血栓等活性[3，4]。因采收期[5]、加工方法[6]和产地[7]等不同，丹参药材质量差异很大，外观性状主要表现在颜色差异上，传统经验认为“色红为好”，但缺乏客观的数据量化标准。本研究采用色差仪测定丹参药材表面颜色，HPLC测定活性成分含量，探讨丹参药材颜色与活性成分含量间的相关性，为制定丹参药材等级标准提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　供试丹参根系于2014年12月20日采自山东中医药大学药用植物园二年生丹参植株，原植物经山东中医药大学周凤琴教授鉴定，确认为唇形科鼠尾草属植物丹参。
　　将根系刨出后，去净泥土，截取直径0.8～1.0 cm的主根根段若干，长度20 cm左右。据根段表面红色程度分为4个级别：1级：砖红色，红色程度最高；2级：棕红色，红色程度较高；3级：淡棕红色，红色程度较低；4级：棕褐色，红色程度最低。保持条件一致，统一晒干。干燥后，以色差仪测定药材表面颜色，然后粉碎，粉末置于干燥器中保存备用，以HPLC测定活性成分含量。各颜色级别丹参平行重复试验3次。 　　1.2 仪器与试剂
　　Aglient1260系列高效液相色谱仪，包括四元泵（G1311C）、自动进样器（G1329B）、柱温箱（G1316A）、检测器（G1315D）、Chem Station色谱数据工作站，美国安捷伦公司；精密电子天平（CP225D），上海精密科学仪器有限公司；超声波提取器（KQ-500DE， 500 W），昆山市超声仪器有限公司；高速多功能粉碎机（25 000 r/min），上海树立仪器仪表有限公司；色差仪（WF30），深圳市威福光电科技有限公司。
　　迷迭香酸（20120809）、紫草酸（PF0225SA14）、丹酚酸B（PA0418RA13）、二氢丹参酮Ⅰ（KN1113GU14）、丹参酮ⅡA（20130111），购自上海源叶生物科技有限公司；丹参酮Ⅰ（110867-200406）、隐丹参酮（110852-200806），购自中国食品药品检定研究院。磷酸、乙腈均为色谱纯，甲醇为分析纯，娃哈哈纯净水。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 药材表面颜色测定 测定条件：光源D65，标准观察角度10°，波长扫描范围780～380 nm，照明口径Ф50 mm，扫描速度600 nm/min，仪器误差ΔE*ab 0.2以内，重复性标准偏差ΔE*ab 0.05以内，数据用L*a*b*色空间法表示。其中L*为亮度值，L*值越大亮度越高；a*为红-绿色轴，a*值越大越红，a*值越小则越绿；b*为黄-蓝色轴，b*值越大越黄，b*值越小则越蓝。
　　样品测量方法：取各颜色级别丹参药材，将平整处平铺在色彩色差仪测试口处，测定其表面颜色，随机扫描10次，取均值。
　　1.3.2 活性成分含量测定 色谱条件：①水溶性成分：色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.026%磷酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脱流动相比例：0～15 min，A相83%～77%，B相17%～23%；15～30 min，A相77%～75%，B相23%～25%；30～40 min，A相75%～10%，B相25%～90%；40～60 min，A相10%，B相90%。波长286 nm；流速1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量10 μL。理论塔板数按丹酚酸B计不低于3 000。②脂溶性成分：色谱柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为0.026%磷酸（A）和乙腈（B）。梯度洗脱流动相比例：0～20 min，A相80%～40%，B相20%～60%；20～60 min，A相40%～20%，B相60%～80%。波长270 nm；流速1.0 mL/min；柱温：25℃；进样量10 μL。理论塔板数按丹参酮ⅡA不低于3 000计。
　　对照品溶液制备：①水溶性成分：分别精密称取干燥的水溶性对照品紫草酸0.68 mg、迷迭香酸0.40 mg、丹酚酸B 0.33 mg，分别置10、10、5 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇溶解，定容至刻度，配制成对照品贮备液，再分别配制成质量浓度为8.5、5.0、33.0 μg/mL的溶液。②脂溶性成分：分别精密称取干燥的脂溶性对照品丹参酮ⅡA 0.42 mg、二氢丹参酮Ⅰ0.84 mg、隐丹参酮0.29 mg、丹参酮Ⅰ0.43 mg，分别置5、10、10、25 mL棕色容量瓶中，加75%甲醇溶解，定容至刻度，配制成对照品贮备液，再分别配制成质量浓度为10.5、21.0、7.25、4.3 μg/mL的溶液。
　　样品溶液制备：①水溶性成分：精密称取丹参粉末（过40目筛）0.5 g，置磨口锥形瓶中，加入75%甲醇50 mL，50℃超声提取40 min，冷却称重，并用75%甲醇补足减失重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液备用。②脂溶性成分：精密称取丹参粉末（过40目筛）0.5 g，置磨口锥形瓶中，加入甲醇50 mL，50℃超声提取40 min，冷却后称重，并用甲醇补足减失重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液备用。
　　1.4 方法学考察
　　1.4.1 线性关系的考察 取上述水溶性和脂溶性对照品溶液各1、5、10、20、30、40 μL，按色谱条件进样，以进样量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的回归方程分别为Y=1332.3X+4.2293、Y=785.80X+8.0610、Y=1390.7X+30.454、Y=3175.0X-6.4643、Y=6431.6X+0.9414、Y=5317.9X-0.4518、Y=9957.1X+0.6733，线性相关系数R2分别为0.9996、0.9991、0.9995、0.9997、1.0000、1.0000、1.0000，测定范围分别为0.025～0.200、0.0425～0.2550、0.033～20.640、0.021～0.840、0.00725～0.29000、0.0043～0.1720、0.0105～0.4200 μg。
　　1.4.2 精密度和稳定性试验 经测定，其RSD值均小于3%，表明方法稳定、可行。
　　1.5 数据处理
　　数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同级别药材表面色度值差异
　　1、2、3、4级的L*值逐渐升高，而a*、b*值逐渐降低（见表1）。其中，a*值越大，颜色越红，与传统分类标准相符，因此，可以利用色差仪测定的色度值对丹参药材进行客观分级。
　　2.2 活性成分含量测定
　　2.2.1 水溶性成分 迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 3种水溶性成分的色谱图见图1，含量见表2。结果显示，丹参药材水溶性成分，呈现出颜色越红含量越高的趋势。迷迭香酸含量在颜色为棕褐色时显著降低，紫草酸、丹酚酸B含量在棕红色时就有显著降低。颜色变化对含量影响最大的是丹酚酸B，各颜色级别之间均有显著性差异。颜色最红的1级砖红色丹参中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B及三者总含量分别是4级棕褐色丹参的1.127、1.185、1.561及1.540倍。 　　2.2.2 脂溶性成分 二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮4种脂溶性成分的色谱图见图2，含量见表3。结果显示，丹参药材脂溶性成分仍然显示出颜色越红含量越高的趋势。除二氢丹参酮Ⅰ在砖红色与棕红色之间没有显著差异外，其它成分在各颜色级别中均存在显著性差异，提示颜色变化对脂溶性成分含量的影响要比水溶性成分大。颜色最红的1级砖红色丹参中的二氢丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮及四者总含量分别是4级棕褐色丹参的2.077、2.625、4.724、3.957及4.086倍。
　　2.3 药材表面颜色与活性成分含量间的相关性分析
　　由表4可知，丹参药材中的各种活性成分含量与L*值均为负相关，其中迷迭香酸、丹酚酸B、丹参酮Ⅰ含量及水溶性成分总含量与L*值呈极显著负相关（P<0.01）；各活性成分含量与a*、b*值均为正相关，其中隐丹参酮、丹参酮ⅡA及脂溶性成分总含量与a*、b*值均呈极显著正相关（P<0.01）；紫草酸和二氢丹参酮Ⅰ含量与各色度值之间的相关性未达显著水平（P>0.05）。可见，丹参水溶性成分含量与L*相关性更高，而脂溶性成分含量与色度值a*、b*的相关性更高。
　　3 结论与讨论
　　3.1 利用色差仪对丹参药材颜色进行测量，划定了各颜色级别丹参的L*、a*、b*值范围，可根据L*、a*、b*值的大小对丹参药材进行等级划分。另外，丹参颜色越红，a*值也越大，与传统经验理论相符。
　　3.2 各颜色级别丹参间多数活性成分含量存在显著性差异。除紫草酸和二氢丹参酮 Ⅰ 外，各成分含量与色度值L*、a*、b*之间相关性均达到显著或极显著水平，其中水溶性成分含量与L*相关性更高，而脂溶性成分含量与a*、b*的相关性更高。
　　3.3 本试验结果表明，依据色度值大小判断药材质量好坏，可作为一种快速、简便评价药材质量的新方法。不仅佐证了传统经验认为的丹参药材“色红为好”，而且为丹参质量评价提供了量化标准，避免了主观评价的主观性、模糊性及不确定性。
　　参 考 文 献：
　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[K].北京：中国医药科技出版社，2010.
　　[2] 赵娜，郭治昕，赵雪，等.丹参的化学成分与药理作用[J].国外医药・植物药分册，2007，22（4）：155-160.
　　[3] 孙克勤，李素芝，刘厚东，等.丹参对高原人鼠缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国民间医学杂志，2005，17（1）：10-11.
　　[4] 邓惠英.丹参及其有效成分的药理研究概况[J].现代医药卫生，2007，23（12）：1812-1813.
　　[5] 姜卫卫，张永清，李佳.丹参最佳采收期初讨[J].现代中药研究与实践，2008，22（1）：12-14.
　　[6] 赵志刚，郜舒蕊，侯俊玲，等.不同产地加工方法对山东丹参药材质量的影响[J].中国中药杂志，2014，39（8）：1396-1400.
　　[7] 金樟照，祝明，张文婷，等.不同产地丹参水溶性成分和脂溶性成分指纹图谱测定及相关性研究[J].中草药，2004，35（10）：100-103.
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