肉种鸡禽白血病与马立克氏病混合感染的初步诊断

作者:未知

  摘要    2018年11月,江苏省某肉种鸡场26周龄鸡群出现采食下降、精神沉郁、消瘦、产蛋下降、死亡等癥状,临床剖检主要病变为肝脏、脾脏肿大,表面可见灰白色结节,腺胃、肾脏肿大,胸骨上可见圆形白色肿瘤病灶。为了明确肉种鸡发病的原因及确定病原,无菌采取肝脏、肾脏等病变组织,开展了PCR鉴定和组织病理学观察等实验室诊断。结果表明,病料PCR检测禽白血病毒和马立克氏病毒为阳性,组织病理学观察发现肝脏、脾脏、腺胃、心肌内弥漫大量MD和ALV-J特有肿瘤细胞。上述结果初步表明,该病例为J亚群禽白血病病毒与马立克氏病病毒混合感染。
  关键词    肉种鸡;禽白血病;马立克氏病;混合感染;诊断
  中图分类号    S858.31        文献标识码    A        文章编号   1007-5739(2019)09-0199-03
  禽白血病(AL)是由禽白血病病毒(ALV)感染引起的免疫抑制性疾病以及各种可传播的良性和恶性肿瘤[1]。ALV属于反转录病毒科C型反转录病毒属,分为A~K 11个不同亚群,其中A、B、C、D、E、J、K 7个亚群可自然感染鸡[2],J亚群禽白血病病毒的致病力和感染性较强[3],可引起肉鸡、蛋鸡、种鸡髓细胞样瘤细胞增生的一种肿瘤性疾病,在世界范围内广泛存在,目前临床上多见骨髓细胞瘤或血管瘤与骨髓细胞瘤混合发生的病例[4]。鸡马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的淋巴组织增生和淋巴肿瘤的一种疾病[5]。MDV属于疱疹病毒科一种α疱疹病毒,这种病毒具有高度的传染性,常以外周神经和其他各种组织器官的单核细胞浸润形成肿瘤为特征。根据病毒株抗原性差异分为3个血清型,并且2~18周龄的鸡均可感染发病,是危害养鸡业的重要传染病。禽白血病(AL)和马立克氏病(MD)是家禽常见的2种病毒性肿瘤病,可水平传播、垂直传播,不仅使感染鸡群的生产性能下降,而且容易引起免疫抑制,增加对其他疾病的易感性,给家禽养殖业造成巨大的经济损失[6]。2018 年11月江苏某肉种鸡场发生疑似肿瘤病的鸡群,经临床剖检及实验室鉴定为J亚群禽白血病病毒与马立克氏病病毒混合感染。
  1    材料与方法
  1.1    病料信息
  病料来源于江苏省某肉种鸡场,26周龄黄羽肉种鸡,剖检疑似肿瘤病症状,无菌采集具有典型病变的肝、脾、肾等病料组织用于PCR鉴定以及组织病理学观察。
  1.2    试验材料
  DNA提取纯化试剂盒、2×Easy TaqSuperMix、普通琼脂糖凝胶、DL2000 DNA Marker,根据参照文献[7-8]设计了MDV、REV、ALV的鉴定引物,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,见表1。
  1.3    PCR检测
  采集病鸡肿瘤病变组织,按1∶5加入含适当浓度抗生素的灭菌PBS缓冲液,充分研磨,反复冻融3次后,离心取上清[2],用DNA提取试剂盒抽提组织液中的DNA,置-20 ℃备用。以提取的病毒DNA作为模板进行PCR扩增。反应体系为:DNA模板2 μL,2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL,上游引物和下游引物各1 μL。反应程序为:95 ℃预变性 5 min,94 ℃变性45 s,54 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共30 个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经l%琼脂糖凝胶进行电泳,电泳处理后置于凝胶成像系统中拍照鉴定。
  1.4    病理组织学检测
  用福尔马林固定病变组织(如肝脏、脾脏等),按文献[9]制作石蜡切片,苏木精-伊红染色,进行组织病理学诊断。
  2    结果与分析
  2.1    病鸡剖检症状
  现场剖检发现,病死鸡主要表现为肝脏肿大,表面弥漫性灰白色肿瘤结节,见图1(a)(b);脾脏肿大,有弥漫性灰白色肿瘤结节,见图1(c)(d);胸骨内外侧有圆形白色肿瘤病灶,见图1(e)(f);肠道表面白色肿瘤结节,见图1(g);肾脏肿大,表面弥漫性白色肿瘤结节,见图1(h)。
  2.2    PCR鉴定
  PCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳分析,结REV-LTR引物未扩增出目的条带,MDV-meq扩增出目的条带,大小约为1 058 bp,ALV-P27扩增出目的条带,大小约348 bp(图2)。该病料PCR检测REV为阴性,MDV和ALV为阳性。
  2.3    组织病理学检测
  组织病理学显示:肝内多个肿瘤病灶,肝内肿瘤细胞为MD特有的肿瘤细胞,见图3(a)(b);心肌内大量肿瘤细胞浸润,心肌内肿瘤细胞为MD特有肿瘤细胞,见图3(c)(d);腺胃内大量肿瘤细胞浸润 腺胃内肿瘤细胞为MD特有肿瘤细胞,见图3(e)(f);脾脏1内大量肿瘤细胞浸润,脾脏1内肿瘤细胞为ALV-J特有肿瘤细胞,见图3(g)(h);脾脏2内大量肿瘤细胞浸润,脾脏2内肿瘤细胞为MD特有肿瘤细胞,见图3(j)(k)。
  3    讨论
  禽白血病和马立克氏病是2种病原(分别属于RNA病毒和DNA病毒)完全不同的疾病,并且都以类似的肉眼可见肿瘤病变为特征[10]。随着规模化养殖的扩大,家禽疫病已经变得日益复杂,混合感染已经成为肿瘤病毒、免疫抑制性病毒感染的主要方式,给养殖业造成巨大损失[11]。造成ALV和MDV混合感染的主要原因可能有以下几种:①ALV既可以垂直传播,又可以水平传播,祖代鸡场白血病净化不彻底,通过种鸡垂直传染给下一代,从而引起雏鸡产生免疫抑制,免疫应答下降,即使雏鸡接种MDV疫苗,仍会感染MDV野毒而发病;②除自然传播方式外,接种了被外源性ALV污染的弱毒活疫苗,也会引起ALV的感染;③雏鸡在免疫MDV疫苗时,免疫过程出现了问题,则会导致免疫效果降低或者免疫失败,使鸡群感染MDV野毒引起机体免疫抑制,最终通过水平传播感染ALV[5];④养殖环境生物安全方面的缺失、饲养环境恶劣、粗放的饲养管理等也会促进病原的扩散与传播[11]。   本试验从江苏省某肉种鸡场采集病料,根据临床解剖病变,PCR扩增及病理组织学分析,最终初步診断该病例为J亚群禽白血病病毒与马立克氏病病毒混合感染。J亚群禽白血病肿瘤的原发部位在骨髓,骨膜下可见白色石灰样增生的肿瘤组织,隆起于骨表面[12]。对于此种混合感染的情况,目前主要实行净化种群为主的综合性防制措施[10]。注射疫苗是预防MD的有效方法,从CVI988/Rispens、814株单苗到cVI988/
  Ripense+HVI二联疫苗,每类疫苗能在一段时期内有效控制其发生[11];对于AL,目前还没有有效的疫苗,更没有有效的药物可以治疗。因此,比较好的办法就是加强净化淘汰,自行清除ALV—J阳性的鸡群或者引进国外鸡群时加强ALV—J筛查,最后逐步建立无ALV—J感染的鸡群,改善饲养环境[13]。同时,还应加强种鸡的饲养管理和严格的生物安全措施,以减少水平传播,并选择无外源病毒污染的疫苗进行合理免疫,避免因疫苗污染而导致鸡群感染禽白血病[14]。本试验诊断为该鸡场下一步的预防和净化工作起到一定的参考作用。
  4    参考文献
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  作者简介   史荣华(1987-),男,江苏泰州人,硕士,从事病毒免疫学研究工作。
  收稿日期   2019-01-08
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