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秘鲁鱿鱼皮酸溶性胶原蛋白提取工艺优化及其特性

来源:用户上传      作者:刘梦

  摘 要:以秘鲁鱿鱼皮为原料,通过单因素试验及响应面优化法得到秘鲁鱿鱼皮酸溶性胶原蛋白(acid soluble collagen,ASC)最佳提取工艺,并对ASC的理化特性进行研究。结果表明:最佳提取工艺为在4 ℃条件下,冰醋酸浓度0.47 mol/L、液料比24.5 mL/g,浸泡43 h后,ASC提取率为31.76%;紫外全波长扫描结果表明,所得ASC在231 nm波长处有最大吸收峰,符合Ⅰ型胶原蛋白特征;凝胶电泳分析表明,提取的ASC含有α1、α2和β链;拉曼光谱分析表明,所得ASC结构完整,三螺旋结构未受到破坏;ASC的相变温度为50.07 ℃。
  关键词:秘鲁鱿鱼皮;酸溶性胶原蛋白;提取;蛋白特性
  Abstract: The extraction of acid soluble collagen (ASC) from jumbo squid skin was optimized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology (RSM). Physiochemical properties of ASC were analyzed. The results demonstrated that the optimum extraction conditions that provided the maximum yield of ASC (31.76%) were determined as 4 ℃, 0.47 mol/L, 24.5 mL/g and 43 h for temperature, acetic acid concentration solvent-to-solid ratio and extraction time, respectively. The results of UV full wavelength scanning indicated that ASC had a maximum absorption peak at 231 nm wavelength, which was typical of type-Ⅰ collagen. In addition, the result of gel electrophoresis showed ASC contained α1, α2 and β chains. Moreover, Raman spectral analysis illustrated that the structural integrity of ASC was intact without any damage to its triple helical structure. The phase transition temperature of ASC was determined to be 50.07 ℃.
  Keywords: jumbo squid (Dosidicus gigas) skin; acid soluble collagen; extraction; protein characteristics
  秘鲁鱿鱼(Dosidicus gigas)为大洋性浅海种,属于茎柔鱼属,最大胴体长1.5 m,最大体质量40 kg,在秘鲁和智利沿岸及外海资源丰富,资源量700~1 000 万t。鱿鱼因其丰富的营养价值,深受消费者喜爱。目前,市场上的鱿鱼制品是将鱿鱼去皮、去头及去内脏后,加工成速冻产品或即食食品,而小部分加工副产物用以加工制作成动物饲料,其余大部分则被丢弃,造成资源浪费和环境污染。鱿鱼加工副产物中鱿鱼皮所占比重最大,约占鱿鱼总质量的10%[1-2]。鱿鱼皮中富含大量胶原蛋白,具有美容、调节免疫力、降血压、抗氧化等作用。
  目前,有關鱼皮胶原蛋白提取的文献较多,尤其是罗非鱼[3-4]、鳕鱼[5-6]、马面鱼[7-8]等,有关鱿鱼皮胶原蛋白的提取近年来也有报道。但鱿鱼皮胶原蛋白提取大多采用酶提法,得到胶原蛋白肽[9-10],采用酸提法得到酸溶性胶原蛋白(acid soluble collagen,ASC)且对提取条件进行优化的报道较少。
  本研究采用酸提法提取秘鲁鱿鱼皮中的ASC,通过单因素及响应面优化法,确定鱿鱼皮中ASC的最佳提取工艺,并对所提取的ASC特性进行分析,以期得到提取率高、结构完整的鱿鱼皮胶原蛋白,为鱿鱼皮的综合利用提供理论基础,提升水产品副产物价值,减少资源浪费。
  1 材料与方法
  1.1 材料与试剂
  秘鲁鱿鱼皮 北京市北水嘉伦水产品市场有限责任公司。
  氢氧化钠、正丁醇、冰乙酸、氯化钠、四甲基乙二胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝R-250(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;30 g/100 mL聚丙烯酰胺储备液、1.0 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)、1.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.8)、10 g/100 mL十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(含0.125 mol/L Tris、1.25 mol/L甘氨酸、0.5 g/100 mL SDS)、5×SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(含10 g/100 mL SDS、0.25 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)、体积分数50%甘油、0.5 g/100 mL溴酚蓝、5 g/100 mL β-巯基乙醇) 北京兰杰柯科技有限公司;蛋白Marker(11~245 kDa) 北京索莱宝科技有限公司。   1.2 仪器与设备
  DZF-6050真空干燥箱 北京莱凯博仪器设备有限公司;Milli-Q超纯水系统 默克密理博实验室设备(上海)有限公司;Sorvall LYNX-6000离心机 美国赛默飞世尔科技公司;UV-2800紫外-可见分光光度计 美国尤尼柯公司;DYCZ-24KS凝胶电泳槽 北京六一生物科技有限公司;PowerPac Universal电泳仪电源、Gel Doc XR+凝胶成像仪(配Image Lab Software) 美国Bio-Rad公司;TS-200摇床 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;XploRA Plus拉曼光谱仪 日本Horiba公司;Q200差示扫描量热(differential scanning calorimetry,DSC)仪 美国TA公司。
  1.3 方法
  1.3.1 秘鲁鱿鱼皮基本成分测定
  水分含量测定:参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》[11];蛋白质含量测定:参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[12];脂肪含量测定:参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[13];灰分含量测定:参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》[14]。
  1.3.2 秘鲁鱿鱼皮预处理
  将秘鲁鱿鱼皮置于4 ℃冷库中解冻,至中心温度达到0 ℃以上;将解冻后的秘鲁鱿鱼皮用超纯水洗净后,切成1.0 cm×1.0 cm,4 ℃贮藏备用。
  参考Matmaroh等[15]的方法,取适量秘鲁鱿鱼皮用超纯水冲洗干净,在4 ℃条件下,以液料比20 mL/g加入0.1 mol/L NaOH溶液浸泡20 h,以除去秘鲁鱿鱼皮中的非胶原蛋白;然后用超纯水冲洗秘鲁鱿鱼皮至pH值中性,沥干后,以液料比10 mL/g加入10 g/100 mL正丁醇溶液,搅拌浸泡20 h,以除去秘鲁鱿鱼皮中的脂肪,然后用超纯水冲洗鱿鱼皮至中性,沥干,备用。
  1.3.3 秘鲁鱿鱼皮ASC的提取
  参考Wu Xiaosa等[16]的方法,取100 g预处理后的秘鲁鱿鱼皮,按一定的液料比加入一定浓度的冰醋酸,在4 ℃条件下搅拌浸泡一定时间后,4 ℃、10 000 r/min离心15 min,取上清液,将未提取完全的秘鲁鱿鱼皮再次用等体积同浓度冰醋酸提取,合并上清液;向上清液中加入一定量的NaCl,至NaCl终浓度为0.9 mol/L,静置4 h;在4 ℃条件下5 000 r/min离心20 min,弃上清液;将沉淀溶于相同浓度的冰醋酸,在4 ℃条件下8 000 r/min离心20 min,除去不溶性杂质;将上清液放入透析袋中,在4 ℃条件下进行透析,每8 h换1 次超纯水,透析2 次,对透析后的胶原蛋白溶液进行冷冻干燥,得到ASC。
  1.3.4 单因素试验设计
  1.3.4.1 冰醋酸浓度对ASC提取效果的影响
  设置液料比为10 mL/g,浸泡时间为24 h,研究不同浓度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mol/L)冰醋酸对ASC提取效果的影响。
  1.3.4.2 浸泡时间对ASC提取效果的影响
  设置冰醋酸浓度为0.5 mol/L,液料比为10 mL/g,研究不同浸泡时间(12、24、36、48、60 h)对ASC提取效果的影响。
  1.3.4.3 液料比对ASC提取效果的影响
  设置冰醋酸浓度为0.5 mol/L,浸泡时间为24 h,研究不同液料比(10、15、20、25、30 mL/g)对ASC提取效果的影响。
  1.3.5 秘鲁鱿鱼皮ASC提取工艺响应面优化
  根据单因素试验确定各因素的取值范围,结合Box-Behnken试验原理,以冰醋酸浓度、浸泡时间和液料比为自变量,以ASC提取率为响应值进行响应面优化试验,Box-Behnken设计因素水平及編码如表1所示。
  1.3.6 ASC提取率测定羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸,参照GB/T 9695.23—2008《肉与肉制品 羟脯氨酸含量测定》[17]测定羟脯氨酸含量,胶原蛋白含量通过羟脯氨酸含量乘以换算系数11.1得到[3]。本研究通过羟脯氨酸含量计算ASC提取率。ASC提取率按下式计算。式中:C为ASC中羟脯氨酸含量/%;C0为秘鲁鱿鱼皮中羟脯氨酸含量/%。
  1.3.7 ASC特性分析
  对采用优化工艺提取的ASC进行蛋白特性分析。
  1.3.7.1 紫外全波长扫描
  参考Jeevithan等[18]的方法,稍作修改。取0.1 g ASC溶于100 mL 0.1 mol/L冰乙酸溶液中,得到1 mg/mL ASC溶液,以0.1 mol/L冰乙酸作为空白对照;在190~400 nm波长范围内对ASC溶液进行扫描。
  1.3.7.2 SDS-PAGE分析
  参考Laemmli[19]的方法,稍作修改。取0.2 g ASC溶于100 mL 0.1 mol/L冰乙酸溶液中,得到2 mg/mL ASC溶液,取0.4 mL ASC溶液与0.1 mL上样缓冲液混合,沸水浴3~5 min;采用8 g/100 mL分离胶和5 g/100 mL浓缩胶,取20 μL ASC溶液与5 μL蛋白Marker上样,采用直流恒压电源,浓缩胶电压为90 V,进入分离胶后电压调至120 V,结束后取出电泳胶进行染色,染色30 min后脱色2 h,脱色后采用凝胶成像系统进行拍照。
  1.3.7.3 拉曼光谱扫描
  参考曹锦轩等[20]的方法。取0.2 g ASC溶于100 mL 0.1 mol/L冰乙酸溶液中,得到2 mg/mL ASC溶液,用50 倍镜头将激光聚焦于载玻片上的ASC溶液,采用532 mm离子激光器,分辨率1 cm-1,获取400~2 800 cm-1的拉曼光谱,并用Labspcc对光谱进行多点基线校正,去除荧光背景。   1.3.7.4 DSC分析
  参考纪倩等[21]的方法。取3~5 mg ASC置于坩埚内,压盖,以空白坩埚作为参比。温度扫描范围20~200 ℃,升温速率5 ℃/min,记录吸热曲线。
  1.4 数据处理
  采用Design Expert 10.0软件进行数据分析,每个样品重复测定3 次,实验结果用平均值±标准差表示。
  2 结果与分析
  2.1 秘鲁鱿鱼皮基本成分
  由表2可知,秘鲁鱿鱼皮中含有大量水分,其次是蛋白质,约占干物质的90%,这与魏薇薇等[2]的阐述一致。通过GB/T 9695.23—2008《肉与肉制品 羟脯氨酸含量测定》测得秘鲁鱿鱼皮中羟脯氨酸的含量为1.17%,胶原蛋白含量为12.99%,占蛋白质总量的70.75%,可见秘鲁鱿鱼皮中胶原蛋白含量较高,是一种提取水产胶原蛋白的优质原料。
  2.2 单因素试验结果
  2.2.1 冰醋酸浓度对ASC提取效果的影响试验结果
  由图1可知,随着冰醋酸浓度增加,ASC提取率呈先上升后下降的趋势,冰醋酸浓度为0.5 mol/L时ASC提取率最高,为18.57%。这可能是由于低pH值有利于ASC的溶出,但pH值过低会造成蛋白质变性,影响提取效率。因此,选择0.3、0.5、0.7 mol/L 3 个浓度进行响应面试验。
  2.2.2 浸泡时间对ASC提取效果的影响试验结果
  由图2可知,随着浸泡时间的延长,ASC提取率逐渐增加。浸泡时间为12~36 h时,ASC提取率增加较快;36 h后,ASC提取率增加较慢,提取率为19.38%~20.02%。因此,选择浸泡时间24、36、48 h进行响应面试验。
  2.2.3 液料比对ASC提取效果的影响试验结果
  由图3可知,随着液料比的增加,ASC提取率逐渐上升。液料比10~20 mL/g时,ASC提取率增加明显;液料比高于20 mL/g时,ASC提取率增加缓慢,提取率为25.40%~26.14%。因此,选择液料比为15、20、25 mL/g进行响应面试验。
  2.3 响应面优化ASC提取工艺结果及分析
  2.3.1 响应面试验设计及结果
  按照Box-Behnken中心组合设计响应面试验,结果如表3所示。利用Design Expert 10.0软件对数据进行拟合,得到冰醋酸浓度(A)、浸泡时间(B)、液料比(C)对秘鲁鱿鱼皮ASC提取率的标准回归方程为Y=29.04-0.82A+1.21B+3.07C-0.31AB+0.45AC+0.92BC-1.85A2-1.85B2-1.96C2。
  可知,模型P<0.000 1,说明模型极显著,失拟项P=0.205 9>0.05,不显著,说明模型拟合程度良好。相关系数R2=0.998 6,说明模型很好地解释了99.86% ASC提取率的變化,各因素间线性相关性好,实验误差小。从各项系数的显著性分析检验可以看出,各项对ASC提取率的影响均极显著。
  2.3.3 ASC提取工艺最佳条件
  经过优化分析,得到秘鲁鱿鱼皮ASC的最佳提取工艺为冰醋酸浓度0.47 mol/L、浸泡时间42.80 h、液料比24.49 mL/g,得到的理论提取率为30.82%。结合实验的可操作性,将提取条件优化为冰醋酸浓度0.47 mol/L、浸泡时间43 h、液料比24.50 mL/g,在此条件下得到的实际提取率为(31.76±0.26)%,与理论值相差0.94%,证明该模型的拟合度良好,可以通过响应面优化试验数据得到最佳工艺参数。
  2.4 ASC特性分析
  2.4.1 紫外全波长扫描结果
  蛋白质大多富含色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸,在280 nm波长处存在明显的紫外吸收峰[22]。但胶原蛋白基本不含这些芳香族氨基酸,因此在280 nm波长处无明显吸收峰,但其富含羟脯氨酸和脯氨酸,使得胶原蛋白在230 nm波长左右有明显的紫外吸收峰。因此,可以通过紫外吸收光谱对胶原蛋白进行分析。
  由图7可知,采用优化后工艺提取的秘鲁鱿鱼皮ASC在231 nm波长处存在明显吸收峰,而在280 nm波长处无明显吸收,这可能是C=O的n→π*跃迁,且样品中芳香族氨基酸含量很低所致[23]。这与鲍虹蕾[3]、Tamilmozhi[24]等报道的鱼类Ⅰ型胶原蛋白特性分析结果相一致。
  2.4.2 SDS-PAGE分析结果
  由图8可知,秘鲁鱿鱼皮ASC中存在α链和β链,其中α链2 条,分别为α1链和α2链,分子质量120 kDa左右。分子质量200 kDa附近存在1 条明显的β链,β链为α链的二聚体,说明ASC分子中存在分子内和分子间的交联作用[25]。但β链上方未出现γ链,说明ASC样品中γ链含量非常低。图中α2链条带下方无其他条带,说明本方法提取的ASC纯度较高。
  2.4.3 拉曼光谱扫描结果
  拉曼光谱中酰胺Ⅰ带位于1 650 cm-1附近[26],主要反映肽键C=O的面内伸缩振动,是胶原蛋白分子二级结构的特征吸收[27];酰胺Ⅲ带主要分布于1 230~1 350 cm-1[28],由C-N的伸缩振动和N-H平面内的弯曲引起,归属于甘氨酸骨架和脯氨酸侧链的-CH2摇摆[26]。
  由图9可知,秘鲁鱿鱼皮ASC的酰胺Ⅰ带和Ⅲ带分别出现在1 644.78、1 322.79 cm-1处,且酰胺Ⅰ带和Ⅲ带之间存在1 个明显的吸收峰,该吸收峰表明样品中螺旋结构的存在[29-30],说明本方法提取的ASC结构完整,三螺旋结构未受到破坏。
  2.4.4 DSC分析结果
  在较高温度下,胶原纤维发生收缩,胶原蛋白的结构会被破坏,通过DSC可以分析升温过程中胶原蛋白螺旋结构变成无规卷曲结构时的热收缩温度。   由圖10可知,DSC曲线中存在1 个放热峰,表明ASC在此存在相变,相变温度为50.07 ℃,此时相变放热量为306.3 J/g。研究表明,亚氨基酸吡咯环形成的非共价键有助于胶原蛋白三螺旋结构的稳定,因此,羟脯氨酸和脯氨酸含量与胶原蛋白热稳定性密切相关[31]。本方法提取的鱿鱼皮ASC热稳定性与已报道的水产胶原蛋白特性相一致[32-33]。
  3 结 论
  以秘鲁鱿鱼加工副产物鱿鱼皮为原料,以ASC提取率为指标,对冰醋酸浓度、液料比和浸泡时间进行单因素试验和响应面试验优化,得到秘鲁鱿鱼皮ASC最佳提取工艺。通过紫外全波长扫描、SDS-PAGE、拉曼光谱及DSC测定提取的ASC特性,发现采用最佳工艺提取的ASC属于典型的Ⅰ型胶原蛋白,含有α1、α2和β链,且蛋白结构完整,三螺旋结构未被破坏,其热变性温度为50.07 ℃。本研究可为制备水产胶原蛋白包装材料提供理论依据,并为秘鲁鱿鱼皮进一步加工利用提供参考,进而提高秘鲁鱿鱼副产物价值,减少资源浪费。
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