基于近场熔体静电纺丝PCR微流控芯片的构建与应用

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　　摘 要
　　本文介绍了一种利用近场熔体静电纺丝直写技术制作PCR（聚合酶链反应，英文全称为：Polymerase chain reaction）微流控芯片的工艺。本文先介绍了利用近场熔体静电纺丝直写技术在导电玻璃上面制作PCL纤维的过程，再介绍了PCR微流控芯片的内部结构设计，接着就介绍了PCL纤维的热处理工艺以及芯片的制作方法，最后介绍了DNA提取与应用PCR微流控芯片验证PCR实验的效果。
　　关键词
　　近场熔体静电纺丝;PCR;微流控
　　中图分类号： P313.1                        文献标识码： A
　　DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.05.007
　　0 前言
　　PCR（聚合酶链反应，英文全称为：Polymerase chain reaction）[1， 2]是一种可以在生物体外进行的生物反应，能够对DNA片段进行选择性快速扩增[3，4]，在分子生物学的各个领域都有广泛的应用[5]。制作PCR微流控芯片的关键是微结构的制作[6，7]，微结构的制作方式多种多样，例如，利用减材制造的方式，如化学腐蚀、激光加工、光刻等;利用等材制造的方式，如压印、注塑等;利用增材制造的方式，如3D打印、近场静电纺丝等。这些制作工艺各有其特点，化学腐蚀具有难以控制加工量的多少，会产生污染液，加工时间比较长的特点;激光加工需要昂贵的激光设备，制造精度由激光设备的精度决定，加工时间比较短;光刻可以加工超高精度的PCR微流控芯片[8]，但设备昂贵，工艺复杂;压印需要制造一个对应的模具，而模具的生产需要超精密加工用来实现，但模具难以更改;注塑可能因为模具的一些尺寸太小产生一些空隙、气泡等;一般3D打印设备难以控制打印件表面质量和形状精度;近场熔体静电纺丝技术是一种在高压电场下，沉积纤维可控的技术，基于近场静熔体静电纺丝制作微流控芯片的微结构精度可控，并且可以降低成本，同时还能快速根据用户需求制作不同内部结构的微流控芯片。现阶段近场静电纺丝制作微流控芯片微结构主要是直线型或者十字交叉型微结构，这为制作PCR微流控芯片打下了基础[9]。同时，我们发現纤维由于热应力等因素的影响在冷却过程中表面质量会变差，为了获得表面质量更高的微通道，我们提出了一种近场熔体静电纺丝纤维表面质量改进的方法——酒精气氛下热处理。
　　2006年，孙道恒等提出近场静电纺丝技术[10]，当接收距离在稳定射流阶段，维持PEO溶液射流所需电压变小，纤维的沉积变得可控。他们探究了针头液滴，聚合物溶液浓度，电压，接收距离，速度对纤维形貌的影响。然而，纤维的形状精度及表面质量都不太理想在后续的研究上，孙道恒等利用PEO溶液近场电纺沉积在硅片上PEO纳米纤维作为牺牲层制作了纳通道，其步骤如下：在硅片上沉积纳米尺寸的PEO纤维，对带纤维的硅片镀膜，PEO纤维氯仿超声氯仿处理溶解，清理获得纳米通道。
　　2016年，广东工业大学的梁烽基于相似的技术制作了间距为50微米的纳通道，间距可控的纳通道可以作为光栅此的刻线。然而电纺纤维制作的纳米通道表面质量亦不太理想。
　　2011年T.D Brown等提出了近场熔体静电纺丝技术[11]，PCL在熔融状态具备特别理想的粘度，探究了速度对射流状态的影响，获得有序纤维的条件：平台运动速度大于或等于射流流动速度。2018年广东工业大学的曾俊基于近场熔体静电纺丝直写技术探究了速度[12]，电压，高度，气压，温度对纤维直径的影响，并且利用软光刻方法制作了三种微通道，进行了液滴，层流实验。
　　在本文中，基于近场熔体静电纺丝特性，我们设计了PCR微流控的CAD图形，进行了近场电纺。在观测纤维形貌的过程中，我们发现纤维的表面质量不好，借用本课题组用酒精配置溶液来改善表面溶液近场静电纺丝表面质量，提出了酒精气氛下热处理提高表面质量的方法。采用软光刻的方法使用改善表面质量的近场电纺纤维作为PDMS微通道的模具，制作了PCR微流控芯片。最后，在制作的PCR微流控芯片上进行了相关实验，并用电泳了PCR产物检验芯片有效性。
　　1 实验材料
　　PDMS（polydimethylsiloxane，美国道康宁），导电玻璃（方阻7Ω，购于佛山晶美），PCL（poly（ε-caprolactone），Mv=80000即聚己内酯，购于深圳易生），金黄色葡萄球菌菌株及复苏液（ATCC25923购广东微生物有限公司），PCR缓冲液（购于大连宝日生物科技有限公司），定制薄膜加热系统（厂家上海松导加热传感器有限公司），无水乙醇（AR级，购于阿拉丁），三氯全氟辛基硅烷（AR，购于Sigma-Aldrich）。
　　2 纺丝过程
　　近场熔体静电纺丝直写实验设备的主要组成部分有：压缩气体供气系统、直流高压电系统、X-Y-Z轴运动平台、加热系统、照明系统。纺丝过程按如下步骤：将PCL颗粒装填满带有可调节温度加热器的料筒，料筒针头接负极，导电玻璃平稳地固定在近场熔体静电纺丝直写实验设备的平台上合适的位置上并接高压电正极，将料筒上的加热器温度设置为150℃，压缩空气压供气系统的输出气压设置为4kPa，直流高压电系统的输出电压设置为1.5kV，X-Y-Z轴运动平台的X与Y轴方向的运动速度设置为5mm/s，挤出熔体纺丝的喷头末端到导电玻璃上表面的距离设置为0.9mm，然后根据预先设计好的PCL纤维分布轨迹进行纺丝。
　　3 微流控芯片设计
　　图1所示是所设计的PCR微流控芯片，PCR微流控芯片主要包括三个区域：C区域覆盖的PCL纤维的温度为92℃（用于实现DNA的变性）;B区域覆盖的PCL纤维的温度为72℃（用于实现DNA的延伸）;A区域覆盖的PCL纤维的温度为42℃（用于实现DNA的退火），其他相关参数的具体见于表1。 　　4 热处理及芯片制作
　　将真空电热恒温炉内部温度加热到50℃，保温60min，确保干燥箱内达到50℃，同时把无水乙醇倒入容器内，接着把带有PCL纤维的导电玻璃按照图2中的（c）图的放置方式放在真空电热恒温炉内部，设置电热恒温烘干箱加热温度为65℃、加热时间为120min，使得PCL纤维在无水乙醇一直挥发的气氛下热处理 120min。将热处理后的带纤维玻璃放入真空斧内，滴一滴三氯全氟辛基硅烷进行表面硅烷化处理，将硅烷化表面处理后的PCL纤维倒入，在50℃真空环境下固化4h;取出固化后的PDMS打孔;3.异丙醇清理PDMS表面后 将PDMS，玻璃用氧等离子处理倒，处理后贴合，并热压辅助键合。（图2中，图（a）是近场近场熔体静电纺丝直写实验设备核心部件的示意图，图（b）是带有PCL纤维的导电玻璃，图（c）是AR级无水乙醇对PCL纤维进行热处理的示意图（在此图中，A是玻璃皿，B是AR级无水乙醇，C是带有PCL纤维的导电玻璃，D是放置带有PCL纤维的导电玻璃的玻璃支架，E是干燥箱;另外，实验开始的时候，AR级无水乙醇的液面距离带有PCL纤维的导电玻璃底面距离为1mm。），图（d）是带有PCL纤维的导电玻璃上面覆盖有PDMS熔体冷却后的状态，图（e）是冷却成型后的带有微流控芯片通道的PDMS倒模片，图（f）是微流控芯片通道两端有打孔的PDMS倒模片，图（g）是PDMS倒模片与等面积的玻璃基板进行等离子体键合后的结合体，图（h）是等离子体键合后的结合体在打孔的地方外接特氟龙管道接头）。图3所示的是近场熔体静电纺丝直写实验设备核心部件的实物图。图4是已经键合成功的PCR微流控芯片实物图。图5是加热器和PCR微流控芯片连接在一起的实物图。
　　5 DNA的提取
　　由于金黄色葡萄球菌菌株是冻干粉，需要利用细菌复苏液对菌株进行复苏，将菌株冻干粉与蒸馏水以体积比1：100的比例进行稀释，再把已经稀释菌株的液体与复苏液以1：10的体积比进行混合，取1ml菌株与复苏液的混合液均匀地涂布在玻璃培养皿中的营养琼脂培养基表面，并把培养皿放进电热恒温培养箱，把电热恒温培养箱调至37℃恒温培养24小时。用洁净玻璃镊子刮取一两个菌落放进装有适量DNA提取液的离心管中，把离心管放置在高速离心机以12000r/min的转速进行离心10min，舍弃上清，并置于-20℃保存。
　　6 结果与讨论
　　6.1 纤维表面质量差的形成原因
　　在导电玻璃没加热的前提条件下，利用近场熔体静电纺丝直写技术制作的PCL纤维，令PCL纤维在室温下自然冷却成固态，放在光学显微镜以10倍放大倍数进行观察，得到图6中（a）的观察结果;把带有PCL纤维的导电玻璃放在加热器上面，而加热器放在光学显微镜的物镜的平台上，观察PCL纤维表面的微观结构，其实际操作的实物图如下图6中（d）所示;把加热器快速加热到150℃，光学显微镜同样以10倍放大倍数进行观察，得到下图6中（b）的观察结果;把加热器的电源断掉，移走加热器，把带有PCL纤维的导电玻璃放在光学显微镜的观察平台，令PCL纤维在室温下自然冷却成型，光学显微镜也同样以10倍放大倍数进行观察，得到下图6中（c）的观察结果。由实验图片可以知道，PCL纤维在室温下自然冷却成固态，纤维的微观表面变得粗糙，表面质量很差;重新加热到150℃之后，PCL纤维在受热之后变成熔融状态，纤维的微观表面变得光滑，表面质量很好;受热之后的PCL纤维再一次全部纤维同时在室温下自然冷却成型，此时的纤维的微观表面变得粗糙，表面质量较差，但是比加热器加热前的粗糙度小一点，表面质量好一点。
　　6.2 形成热应力的因素
　　由于PCL纤维在为完全冷却成型之前属于弹性体，弹性体在受热或者冷却过程中会，体积会膨胀或者收缩，从而纤维有可能会的内部形变与外部约束相互约束使得不能自由形变，此时就会产生应力，这就是热应力。在熔融状态的PCL纤维挤出的过程中，由于导电玻璃与空气的比热容不一样，因此PCL纤维与空气接触的表面和与玻璃接触的表面的散热速度不一样，从而会产生其中一部分热应力。由于PCL纤维挤出是有先后顺序的，从而PCL纤维的冷却成型的顺序也会和挤出的先后顺序一样，同一条纤维在同一时刻的不同节段的温度存在一定的差异，因此也会产生一部分热应力。
　　聚合物纤维内外冷却速度不一致，聚合物大分子链在熔融过程中形成的不平衡构象，这种不平衡构象在冷却固化时不能立即恢复到与环境条件相适应的平衡构象。
　　7 基于酒精的热处理工艺
　　在一些微透镜阵列的制作过程中，人们通常利用液体的流动性以及液体表面存在表面张力的特性，对未成微透镜形状的点状树脂、PMMA等熔点较高的高分子材料采用熱回流技术使得高分子材料的形状变成微透镜的形状。但是热回流是利用加热微透镜阵列所在的基板，利用基板的热传导使得熔点较高的高分子材料熔融[13]，如果采用热回流工艺就会造成低熔点PCL材料表面的温度不均匀，而且热回流的加热容易控制温度，但是冷却时的温度难以控制;因此，如果利用热回流进行热处理PCL纤维会产生热应力，难以改善PCL纤维的表面质量。如果对PCL纤维使用热回流技术难以改善纤维表面质量，会使得纤维的高度降低影响PDMS的倒模成型。厦门大学的黄永芳在利用近场静电纺丝技术制作微纳通道的时候[14，15]，把PEO溶于水与乙醇的混合物中制作静电纺丝材料，并得到质量良好的微纳通道。由于酒精具有较强的挥发性能，因此含有PEO的静电纺丝材料能够快速成型、能够尽可能地减少纤维产生应力而造成表面质量很差[16]。因此，本课题的热处理方式就利用酒精的易挥发性，把PCL纤维放置于酒精气氛中进行热处理。
　　由于PCL纤维冷却成型后，其表面质量比较差;从而难以满足用来制作PCR微流控芯片的使用要求，所以要对PCL纤维表面质量进行改善，以达到使用要求。由于PCL纤维对温度的变化比较敏感，因此本课题选用热处理的方式去改善PCL纤维表面质量。对PCL纤维进行热处理的具体方法是：把带有PCL纤维的导电玻璃放在装有AR级无水乙醇的容器的液面上空，导电玻璃下表面距离AR级无水乙醇的液面1mm，把装有AR级无水乙醇的容器放进干燥箱设置不同的温度与时间参数观察最优的实验效果。 　　對PCL纤维进行热处理实验有五组，分别为：在没有酒精气氛环境中把真空电热恒温炉加热至50℃保温60min（图7的c、d）、在没有酒精气氛环境中把真空电热恒温炉加热至60℃保温60min（图7的e、f）、在没有酒精气氛环境中把真空电热恒温炉加热至65℃保温60min（图7的g、h）、在有酒精气氛环境中把真空电热恒温炉加热至50℃保温60min（图7的i、j）、在有酒精气氛环境中把真空电热恒温炉加热至65℃保温60min（图7的k、l）。另外，图7中的a、b是未进行热处理之前的微观表面图。从下面的实验结果图片可以看出，在无酒精气氛的环境中加热至50℃保温60min后，PCL纤维的表面质量并没有得到变好;在无酒精气氛的环境中加热至60℃保温60min后，PCL纤维出现了团聚的现象;在无酒精气氛的环境中加热至65℃保温60min后，PCL纤维的团聚现象更加严重;在有酒精气氛的环境中加热至50℃保温60min后，PCL纤维的表面质量也没有得到变好;在有酒精气氛的环境中加热至60℃保温60min后，PCL纤维的表面质量明显地变得很好了。在热处理的实验中，PCL纤维出现团聚现象的主要原因是PCL在受热后变成熔融状态表面张力和热应力同时作用使得团聚发生;而PCL纤维的表面质量明显地变得很好的主要原因是酒精气氛使得热应力被去除了，而表面张力不足以使其团聚。
　　8 PCR实验
　　PCR扩增：使用TaKaRa Tks Gflex DNA Polymerase（Code No.R060A）进行PCR扩增，PCR反应体系的成分（其中Primer *1为CTG1095 F2，Primer *2为CTG1095 R2）比例是：CTG109 5- DNA：2×Gflex PCR Buffer（ Mg2+， dNTP plus）：Tks Gflex DNA Polymerase（1.25units/ul）：Primer*1（20uM）：Primer*2（20uM）：dH2O的体积比例为1：25：1：1：1：21。实验操作方法：注射泵装好需要进行PCR扩增反应的30μL液体，其输出管直接接PCR微流控芯片的入口处的特氟龙管道接头，PCR微流控芯片的出口处的特氟龙管道接头外接管道把PCR扩增的液体引流到薄壁 Eppendorf管，PID调节温度控制器不同的控制输出分别接到不同的温控区域;实验第一步为利用PID调节温度控制器控制不同区域进行加热，接着控制注射泵把PCR反应体系注入PCR微流控芯片进行PCR扩增反应。
　　如表2为PCR扩增所用的设计的引物名称以及碱基序列，需要进行PCR扩增的nuc基因的正向引物以及反向引物进行扩增的起始碱基位置。理论上提取的DNA片段长度为536bp。
　　把PCR产物各取5ul进行1%琼脂糖凝胶电泳，其电泳的电场强度大小为2V/cm，以标记DNA（M：DL2，000 DNA Marker（购于宝生物工程（大连）有限公司））的电泳条带为参照，分析管内的PCR扩增产物检验扩增的结果。其实验结果图如图8所示，其中图中的标号的含义分别代表M：DL2，000 DNA Marker、1：CTG1095 F2/R2 PCR产物（Primer *1为CTG1095 F2，Primer *2为CTG1095 R2）。
　　DL2，000 DNA Marker由六种不同长度的DNA片段组成，最短的四种DNA片段分别是100bp、250bp、500bp、750bp，即是如图8所示的M列的标注的四种DNA片段。基于这个实验所选的实验环境以及实验材料，这个PCR扩增实验理论上提取的DNA片段长度为536bp，而从图8的DNA电泳图结果可以看出来CTG1095 F2/R2 PCR产物离DL2，000 DNA Marker的500bp的DNA片段电泳中心比较相近，因此可以得出来结论是：此次PCR扩增的效果基本达到预期的效果。
　　9 结论
　　本课题利用了近场熔体静电纺丝直写技术在导电玻璃上制作PCL纤维，然后再对PCL纤维进行热处理，提高了PCL纤维的表面质量，接着就利用PDMS在PCL纤维上面倒模，最后把倒模出来的PDMS微流道键合在洁净的导电玻璃上面做成PCR微流控芯片，最后验证PCR微流控芯片的效果。最终的实验结果表明，此课题中构建的PCR微流控芯片效果达到预期效果，从而具有良好的市场应用场景。
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