西瓜花粉母细胞减数分裂进程观察

来源:用户上传      作者:葛洁 张月乔 田树娟 袁黎

　　摘 要： 减数分裂是有性生殖的关键过程，而西瓜中花粉母细胞的详细减数分裂全过程仍未知。以可进行高效稳定遗传转化的野生型西瓜种质‘ZTC’的雄花花序为研究材料，采用DAPI荧光染色及压片技术对西瓜花粉母细胞减数分裂进程进行了系统观察研究。结果显示，西瓜减数分裂中细胞质分裂是同时型的，胞质分裂直到第二次减数分裂结束才发生，形成四分体。这与大多数双子叶植物相同。整个西瓜花粉母细胞减数分裂遵循双子叶植物减数分裂发育规律，在整个减数分裂进程中，减数第一次分裂前期经历时间较长，减数第二次分裂前期较短。基于对西瓜花粉母细胞减数分裂进程与花蕾直径相关性的分析，可直接从花蕾直径长度、花药颜色等外观形态学特征来判断植物体内花粉母细胞减数分裂所处的时期。不仅从细胞生物学水平阐明了西瓜减数分裂全过程，丰富了西瓜生殖生物学相关研究内容，而且进一步为西瓜杂交育种及育性分析等有性生殖生物学研究提供了细胞学理论基础与技术支持。
　　关键词：西瓜; 花粉母细胞; 减数分裂; 生殖发育
　　Abstract：  Meiosis is a key process in sexual reproduction. The exact meiosis process of pollen mother cells in watermelon is still unknown. Here， to gain detailed knowledge of watermelon reproduction， especially on meiosis， an efficiency and stable regeneration wild watermelon germplasm ‘ZTC’ was used as the research material. The meiosis process of watermelon pollen mother cells was observed by DAPI fluorescence staining and chromosome spreadings. The results showed that watermelon meiosis was a simultaneous type， and cytokinesis did not occur until the end of the second meiosis， which was the same as those of most dicotyledonous plants. The whole watermelon meiosis followed the general principles of dicotyledonous plants meiosis development such as prolonged prophase I and indistinguishable prophase II. Based on the analysis of the correlation between the meiosis process of watermelon pollen mother cells and the diameter of flower buds， the meiosis period of pollen mother cells in plants could be determined directly from the morphological features of flower bud diameter and anther color. Our findings provide relatively accurate method for meiotic stage identification in different watermelon varieties and detailed insights of watermelon meiosis， the cytological basis and technical support for the study of watermelon sexual reproduction biology.
　　被子植物通过双受精完成生殖过程，雌配子卵细胞和中央细胞分别与精细胞融合发育成胚和胚乳。二倍体孢子发育成为单倍体的配子，两性配子结合，形成合子，再发育为新个体。开花植物的配子体分别在雌雄花器官中完成有性生殖。在像西瓜这样的开花植物中，从孢子体期到配子体期的转变包括2个连续的过程，孢子发生和配子体发生。孢子发生的特征是花药原基和胚珠原基中的造孢细胞分别分化成花粉母细胞和胚囊母细胞，单倍体孢子通过连续有丝分裂发育为成熟配子体[1-2]。孢子母细胞通过减数分裂分别产生小孢子（单核花粉粒）和大孢子（单核胚囊），小孢子發育为有1个营养细胞和2个精细胞的成熟花粉粒（雄配子体），大孢子（单核胚囊）发育为成熟的七细胞八核胚囊（雌配子体）[3]。
　　减数分裂在植物生命周期中维持遗传稳定性和丰富变异性方面起着重要作用。在第一次减数分裂过程中，同源染色体发生配对（联会），在这一联会过程中，同源染色体的非姐妹染色单体交叉互换完成基因重组[4]。减数分裂使染色体减半，植物将从二倍体世代转换到单倍体世代。在第二次减数分裂中，姐妹染色单体将移动到细胞的两极，形成新的小孢子或大孢子。减数分裂时发生的同源染色体配对和染色体重组将丰富物种的遗传变异。减数分裂后，减数分裂产生的单核孢子将继续有丝分裂，形成精细胞和卵细胞[5]。受精后精细胞和卵细胞融合形成合子，恢复物种的原始染色体数目，这将在植物繁殖过程中保持遗传物质的稳定。减数分裂是植物提高环境适应和繁殖能力的关键步骤。
　　西瓜（Citrullus lanatus （Thunb.） Matsum. & Nakai）是一种具有很高商业价值的在世界广泛栽培的的园艺作物，是一种典型的双子叶植物，大多雌雄同株，在同一株植物上分别开雄花和雌花。西瓜生殖发育，尤其是减数分裂，对其繁殖、营养形态建成和产量至关重要。然而迄今为止，减数分裂过程只在少数物种中被系统研究过，包括拟南芥、水稻和豇豆等[6-9]。目前有关西瓜细胞遗传学、有性生殖生物学的研究明显滞后，关于葫芦科作物系统的减数分裂进程研究仍未见报道。笔者对高效可稳定遗传转化的野生型西瓜种质‘ZTC’的减数分裂过程进行了研究，并根据花蕾的形态指标总结出一套生殖日历，以期根据生殖器官（如花蕾）的表型特征确定减数分裂的时期，更好地对作物进行田间管理，对不同西瓜材料减数分裂进行预测，并为减数分裂相关基因突变分析提供关键时期的划分和鉴定。 　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　野生型种质‘ZTC’，属于东亚生态型，生长于34～35° N，108～109° E，关中平原与黄土高原过渡坮塬区域。土壤环境为少沙化的黄褐土，抗旱性强且具备一定的抗炭疽病能力。‘ZTC’可进行高效稳定的遗传转化，能为今后的遗传育种研究奠定分子生物学基础，因此选择野生型西瓜种质‘ZTC’为材料展开研究。试验材料于2018年3—7月在西北农林科技大学园艺学院杨凌西甜瓜试验示范基地的塑料大棚内种植。试验地处关中平原， 位于34°25′N，108°20′E，属暖温带半湿润气候带。试验大棚的长度、跨度、高度分别为140.0、9.0、2.8 m，土壤类型为关中塿土，pH值为7.0～8.5，耕层0～20 cm。土壤养分状况为有机质质量分数9.96 g·kg-1，全氮质量分数1.28 g·kg-1，速效磷质量分数50.00 mg·kg-1，速效钾质量分数179.24 mg·kg-1。当西瓜进入生殖生长阶段，即植物生长点处长出不同大小的花蕾时，采集这些花蕾，于卡诺固定液（V乙醇∶V乙酸=3∶1）中固定。花蕾在固定液中固定至少12 h，然后用皮下注射针和镊子切开，取花药用于样品制备。
　　1.2 压片法制片展开染色体
　　花粉母细胞减数分裂的染色体压片法在先前建立的方法基础上进行些许改进[6]。采集的花蕾在卡诺试剂中固定至少12 h，用游标卡尺测量花蕾大小;体视显微镜下解剖出花蕾内部的花药部分，置于载玻片上，加10 mmol·L-1柠檬酸钠缓冲液（pH 4.5）洗涤3次;花药组织加入混合酶液（1.4%β-葡聚糖醛酸苷酶，0.3%纤维素酶，0.3%果胶酶）15 μL，37 ℃恒温箱酶解3 h;酶解完全的花药材料取出置于常温，吸干酶液，水洗3次;水洗涤后的组织用镊子捏碎，加入13 μL的60%冰醋酸使细胞透明化;透明化的花药材料盖上盖玻片，用拇指用力按压盖玻片;将制好的装片放入-80 ℃冰箱至少10 min;取出装片，掀开盖玻片，室温下干燥;干燥后的样品用1.5 mg·mL-1 4，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，Vector Laboratories， Inc. Burlingame， CA）染色。在奥林巴斯荧光显微镜（奥林巴斯BX 63）下观察减数分裂细胞，并使用Spot RT imaging （Diagnostic Instruments， Inc.）拍照。
　　1.3 花蕾直径的测量
　　对于花蕾大小，最大横向直径被用作宽度指标，测量工具为游标卡尺。以西瓜花蕾的横径作为减数分裂关键过程的参数，建立生殖日历。
　　2 结果与分析
　　2.1 野生型西瓜减数分裂过程
　　减数分裂是植物生殖细胞形成的关键步骤。孢子母细胞发育到一定时期便进入减数分裂时期。减数分裂过程较为复杂，可以分为第一次减数分裂和第二次减数分裂，减数分裂I和减数分裂II都可以进一步分为前期、中期、后期和末期。
　　‘ZTC’是高效可稳定遗传转化的野生型西瓜种质（图 1），对光周期敏感，对干旱半干旱地区有很强的适应性，并且在与其他常见生态型如‘97103’的比较当中发现，‘ZTC’的生殖发育过程极具代表性。在西瓜中，每朵雄花有3个花药（图 1-B）。为了研究花粉母细胞减数分裂染色体行为，减数分裂时期的细胞通过酶解从花药中释放出来;DAPI染色在荧光显微镜下观察染色体形态（图 2）。
　　减数分裂前期I经历时间长，染色体变化复杂，根据染色体的细胞学特征，可以进一步分为5个亚阶段，即细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期[10-13]。在前期I的初期，染色体开始凝聚并盘绕，逐渐形成细线状，上面分布着许多大小不同的球状染色体;染色体最终附着在核膜的一部分，呈花束状向另1个方向扩散，这个亚阶段被称为细线期（图 2-A）。父本的一条染色体和母本的另一条染色体具有相似的特征、大小和遗传顺序，称为同源染色体。丝状染色体逐渐靠拢（图 2-B），染色体相互连接和交叉，表明同源染色体开始配对，这种现象被称为联会。联会是染色体之间广泛而稳定的相互作用，包括形成一种叫做联会复合体的复杂蛋白质结构[14]。当同源染色体是部分配对时，配对的染色体明显地“融合”在一起，没有完成配对的染色体分离开（图 2-B），这表明减数分裂细胞处于偶线期。
　　当同源染色体完全联会后，减数分裂细胞进入粗线期，每对配对完全的同源染色体进一步缩短变粗，呈粗线状结构（图2-C）。在粗线期中期，由于联会，细胞核中的染色體对被称为二价体。每个二价体包含4条染色单体，也称为四分体（不同于小孢子成熟时形成的四分体）。此时，二价体中不同染色体的染色单体之间，可能在1个或几个位置交叉，并且发生染色单体片段的交换和重组，而另外2条染色单体保持不变。染色体互换现象被称为交换，这对生物体遗传和变异具有重要意义（图 2-C）。
　　粗线期后，染色体继续浓缩，紧密配对的同源染色体开始分离，但发生交换的地方仍然连接在一起，因此联会染色体呈现X、V、8和0的形状（图 2-D），这个亚期被称为双线期。
　　随后染色体进一步浓缩，高度紧密的二价体进入终变期。从图 2-E可以看出，染色体高度浓缩成点，这个时期是观察和计算染色体数目的最佳时期。前期I结束。
　　当染色体螺旋化凝聚达到最大值时，二价染色体呈点状线性排列在细胞中间的赤道板上（图 2-F）。这一阶段被称为中期I，纺锤体将着丝粒拉向两极，使同源染色体分离并移动到相对的两极（图 2-G），这一阶段被称为后期I，后期I结束后每个极区的染色体数量只有原来母细胞的一半。后期I之后的时期是末期I，当染色体到达两极时，西瓜染色体在细胞中解螺旋展开，核膜组重新包裹染色体（图 2-H） 。
　　西瓜的第二次减数分裂紧接着第一次减数分裂之后，分裂间期非常短。染色体在前期II重新螺旋缩短（图 2-I），2组染色体被中间的细胞板隔开。进入中期II，2组染色体分别排列在赤道板上（图 2-J）。随后在后期II，姐妹染色单体彼此分离，形成了4个新染色体簇（图 2-K）。在末期II，染色体解螺旋产生4个单倍体子细胞（图 2-L），通过胞质分裂四分体中的细胞各自分离，发育形成4个单核小孢子。 　　从完整的西瓜减数分裂（图 2）可以看出，第1次核分裂不伴有细胞质分裂，只形成双核细胞，没有出现二分体阶段。胞质分裂直到第二次减数分裂结束时才发生，此时形成了4个子细胞（四分体）。因此，西瓜的减数分裂中细胞质分裂是同时型，与大多数双子叶植物的减数分裂相同。
　　2.2 花蕾直径与减数分裂进程的对应关系
　　对不同大小的花蕾的生殖发育阶段进行分类。表 1显示了对应于不同直径大小的花蕾，其内部生殖细胞在减数分裂不同时期数量的百分比。西瓜的减数分裂发生在直径为1.4～3.4 mm的花蕾中（表 1）。在1.4～1.6 mm的花蕾中，减数分裂I开始。由表 1可以看出，不同大小的花蕾均可对应1个明显的减数分裂阶段。例如，在1.6～1.8 mm的花蕾中，统计花蕾中所有生殖细胞，71.6%处于偶线期，25.5%处于细线期，2.9%处于粗线期，由此可见，偶线期为1.6～1.8 mm花蕾的代表时期。此外，相同或相似大小的花蕾中的生殖细胞均处于相同或相邻的阶段，这种现象与植物生殖生长的同步发育规律相一致。例如，当花蕾的直径为2.2～2.4 mm时，内部生殖细胞处于双线期和终变期，除此之外没有其他时期。因此，花蕾大小可以作为减数分裂时期的指标来预测减数分裂的相对发育阶段。
　　前期I与减数分裂其他时期相比相对较长（表 1），表现为直径1.4～2.6 mm花蕾中的生殖细胞仍处于前期I，这也是植物生殖过程中的常见现象。在前期I，同源染色体相互配对以及遗传物质发生交换和重组，丰富了物种遗传性的变异。中期I和后期I都较为短暂，其中当花蕾发育到直径大小为2.4～3.0 mm时，生殖细胞处于中期I和后期I这2个阶段。染色体在很短的时间内移向两极，完成染色体数目的减半。此外，在整个减数分裂时期花药组织的生殖细胞中，处于前期II的生殖细胞数目较少（表1），证明前期II也较短，生殖细胞在经历末期I后很快进入中期II。
　　2.3 雄性配子体发育的生殖日历
　　如图 3和表 2所示，雄性生殖细胞减数分裂可以与花蕾的横向直径相关联，开始于1.4 mm大小的花蕾，止于3.4 mm大小的花蕾。如图 3和表 1所示，从花粉母细胞到成熟单核花粉粒的形成，所有减数分裂事件都与花蕾大小相关。因此，建立的生殖日历是根据不同花蕾直径大小，从而判断其内部生殖细胞减数分裂的具体时期。
　　‘ZTC’减数分裂始于1.4～1.6 mm的花蕾内。染色体首先开始凝聚，形成细线状结构，这表明花粉母细胞在前期I很早就进入细线期（图 3-A，表 2）。当花蕾长到1.6～1.8 mm时，同源染色体部分开始配对，这一时期称为偶线期（图 3-B，表 2）。花蕾横径长到1.8～2.0 mm，同源染色体物完全配对完成，出现1个粗线状结构，称为粗线期（图 3-C，表 2）。当花蕾的直径达到2.0～2.2 mm时（图 3-D，表 2），染色体呈X、V、8和0的形状，当花蕾的直径达到2.2～2.4 mm时（图 3-E，表 2），染色体进一步浓缩呈点状分布。这2个时期分别为双线期和终变期。前期I在花蕾直径达到2.6 mm时结束。
　　纺锤丝牵引染色体，在花蕾直径为2.4～2.6 mm时染色体呈线状排列在赤道板上，对应的时期为中期I （图 3-F，表 2）。由于染色体向两极分离，2.6～2.8 mm的花蕾对应于后期I（图 3-G，表 2）。当花蕾直径为2.8～3.0 mm时，进入末期I （图 3-H，表 2）。
　　相对应的，第二次减数分裂的花蕾直径在2.4～3.4 mm（图 3，表 2）。前期II、中期II和后期II的花蕾直径大小差异不明显，说明减数分裂II时期相对较短。细胞中的2组染色体在2个赤道板上分别线性排列，这一时期为中期II，对应的花蕾直径大小为3.0～3.2 mm（图 3-I，表 2）。当花蕾直径为3.0～3.2 mm时，姐妹染色单体发生分离，然后在后期II形成四组新染色体簇（图 3-I，表 2）。在末期II阶段，花蕾直径通常达到3.2～3.4 mm。染色体解螺旋发生，并进一步产生4个单倍体子细胞（图 3-J，表 2），通过胞质分裂形成4个小孢子。
　　3 讨论与结论
　　西瓜是世界第五大新鲜果品，是我国重要的经济作物。西瓜细胞遗传学、生殖生物学研究对于育性分析、品种改良、遗传育种等研究有明显的指导作用。然而，目前有关西瓜细胞遗传学、有性生殖生物学研究明显滞后，迄今为止，减数分裂过程只在少数物种中被系统研究过，包括拟南芥、水稻和豇豆等[6-9]。关于葫芦科作物系统的减数分裂进程研究仍未见报道。
　　笔者首次对西瓜的减数分裂进程及花药外观形态的相关性进行了较为系统的观察研究，结果对西瓜细胞遗传学及生殖生物学研究都有重要意义。研究结果表明，西瓜花粉母细胞经过2次分裂，最终形成4个子细胞。其中减数分裂第1次分裂（减I期）又可进一步分为前期I、中期I、后期I和末期I 4個时期。前期I相对经历时间最长，对应花蕾直径从1.4 mm开始，至2.6 mm结束。中期I，配对的同源染色体向两极分离，进入后期I和末期I，最终形成2个染色体数目减半的子细胞。子细胞继续进行减数分裂第2次分裂（减II期），同样经历前、中、后、末4个时期，直至形成四分体，减数分裂结束。第二次减数分裂相较第1次来说，时间较短，对应花蕾直径为2.4～3.4 mm。西瓜减数分裂过程遵循大多数被子植物减数分裂规律[15-17]，因此，属于西瓜减数分裂与大多数被子植物减数分裂各个时期的共性特征。
　　除减数分裂共性特征外，笔者还发现西瓜花粉母细胞的减数分裂行为存在一些特殊行为。一般情况下，花粉母细胞减数分裂在药室应表现出同步现象。然而，在供试材料的同一花药的压片中观察发现，花粉母细胞减数分裂进程中，同样直径的花蕾压片结果，却观察到2～7个不同的减数分裂时期（表 1）。尤其，是直径为2.4～2.6 mm的花蕾压片结果表明，34.1%的花粉母细胞处于中期I，有22.2%的细胞仍在终变期，却有12.2%的细胞已经发育到了后期II。减数分裂时期的不同步性，造成了四分体形成的不同步，最终导致雄配子体形成的不同步。究其原因，这种减数分裂进程的不同步性或差异，有可能是由于西瓜种间遗传特性不同造成的，也不排除取样时天气状况以及取样时间等外界环境因素造成的差异。也有研究表明，自然机制（如无融合生殖）或影响孢子发生的特定突变也会造成减数分裂时期和染色体形态的不同步或重大差异[18-20]。然而，这种减数分裂进程的不同步性在一定程度上延长了花期，可降低外界极端环境对散粉或减数分裂的影响而增加授粉几率，增强了种群繁殖能力，是一种生物适应环境的进化机制[21-23]。但是，造成减数分裂不同步的具体原因及机制目前尚不清楚，还有待进一步研究。 　　本研究结果还表明，西瓜花粉母细胞减数分裂进程与其花蕾的外部形态或者直径存在一定的相关性。因此，可通过西瓜雄花花蕾的外部形态或直径对其减数分裂时期进行判断，此结果不仅在西瓜有性生殖生物学、细胞遗传学等研究中具有实际应用价值，也为西瓜育种、品种改良等技术提供了细胞学理论基础。然而，在实际应用中，由于西瓜种属间的差别、生长地区及环境的不同，以及花蕾采集时间、发育时期不同等等多方面因素的影响，花粉母细胞减数分裂进程与花蕾外部形态之间可能存在一定的差异。因此，需要结合临时压片观察花粉母细胞减数分裂进程，同时结合相关性分析进行综合判断，以达到降低外界因素影响、相对准确地确定减数分裂具体时期的目的。
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