不同抗生素及除草剂Basta对大葱愈伤组织分化的影响

来源:用户上传      作者:王清华 刘泽洲 颜冬 陈伟 高莉敏

　　 摘要：为了建立优良的大葱遗传转化体系，以卡那霉素（Kana）、潮霉素（Hyg）以及除草剂Basta（Bar基因）作为抗性选择剂，研究其对大葱愈伤组织分化的影响。结果表明：大葱愈伤组织分化对Kana不敏感，Kana不适宜作为大葱遗传转化中抗性选择标记，Hyg适宜的选择浓度为50 mg/L，除草剂Basta适宜的选择浓度为0.10 mg/L。
　　关键词：大葱;抗生素;除草剂Basta;愈伤组织分化
　　中图分类号：S633.1  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2020）02-0050-04
　　Abstract In order to establish a genetic transformation system for bunching onion， the kanamycin （Kana）， hygromycin （Hyg） and herbicide Basta （Bar gene） were used as selective agents to study their effects on the differentiation of bunching onion callus. The results indicated that the differentiation of bunching onion callus was not sensitive to Kana， so Kana was not suitable as a selection marker for bunching onion. The results also showed that 50 mg/L Hyg and 0.10 mg/L Basta were the suitable selection concentrations for callus differentiation of bunching onion.
　　Keywords Bunching onion;Antibiotics;Herbicide Basta;Differentiation of callus
　　 植物遺传转化技术中，农杆菌介导的转化方法应用广泛，是较为有效的转化方法。该方法需要提前在转化用的质粒载体中插入标记基因，再在选择培养基中加入适宜浓度的抗性选择剂。转化细胞由于具有选择性标记基因， 所以不受选择剂的影响而正常生长[1] ，非转化细胞则不能正常生长而死亡。遗传转化步骤主要包括农杆菌侵染、共培养、选择培养、转基因植株再生等，除侵染和共培养外，其余操作均需要用抗性选择剂来筛选转化体。一个成功的转化体筛选体系主要取决于3个方面：适当的选择性标记基因、适当的选择性试剂和试剂浓度、适当的选择时间[2]。作物、品种以及外植体类型不同，适宜的抗性选择剂和浓度也不相同。因此，筛选一种适合特定材料的抗性选择剂以及适宜的浓度对作物遗传转化研究具有非常重要的意义。
　　大葱（Allium fistulosum L.）属于百合科葱属植物。关于葱属植物遗传转化的研究已有不少报道，主要集中在洋葱[3-6]、大蒜[7-10]上，关于大葱的研究相对较少。杨俊杰[11]以潮霉素（Hyg）作为抗性选择剂对大葱遗传转化进行研究，表明Hyg浓度为50 mg/L 时，大葱愈伤组织停止生长，并在75 mg/L时全部死亡，而以Hyg 50 mg/L进行第1次筛选、分化培养一段时间后，再以75 mg/L进行第2次筛选，效果较佳。
　　本试验以卡那霉素（Kana）、Hyg以及除草剂Basta作为抗性选择剂，设置不同浓度梯度，研究抗生素及除草剂对大葱遗传转化体的筛选浓度，旨在为建立高效的大葱遗传转化体系奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　试验大葱品种为章丘大梧桐。
　　1.2 主要试剂
　　MS培养基、植物激素6-BA和2，4-D均购自生工生物工程（上海）股份有限公司;Kana和Hyg购自北京索莱宝科技有限公司;除草剂Basta购自北京酷来搏科技有限公司。
　　1.3 试验方法
　　大葱愈伤组织培养采用宗红等[12]的试验方法进行，略有改动。挑选饱满成熟的大葱种子，经自来水冲洗10 min、 2%次氯酸钠浸泡消毒30 min、无菌水冲洗3～5次，接种于MS（2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg /L 6-BA）培养基中，诱导产生的愈伤组织40 d左右进行一次继代培养，最后选择黄色、致密、反光性强的愈伤组织用于本次试验。以添加不同浓度的Kana（0、25、50、75、100 mg/L）、Hyg（0、25、50、75、100 mg/L）以及Basta（0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L）的分化培养基（MS +1.5 mg/L 6-BA）为不同处理，分别接种大葱愈伤组织，25℃、3 000 lx下每天光照12 h进行培养，对照不添加抗生素和Basta。每处理10瓶，每瓶接6块愈伤。每10 d 观察记录一次愈伤组织分化情况，共统计4次。
　　1.4 数据分析
　　采用DPS 7.05软件进行数据统计与显著性分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同浓度Kana 对大葱愈伤组织分化的影响
　　由表1可以看出，不同浓度Kana对大葱愈伤组织分化的影响不大。大葱愈伤组织死亡率仅在100 mg/L Kana浓度下培养40 d时为6.7%，其它处理条件下均为零。当Kana浓度为25 mg/L时，不同培养时间的愈伤组织分化率均较对照明显减少，培养40 d时为20%，而随着Kana浓度的继续增加，愈伤组织分化率趋于平稳，不同处理培养40 d的愈伤组织分化率均为8.3%。由此可见，大葱愈伤组织对Kana并不敏感，此抗生素不适宜作为大葱遗传转化的抗性选择剂。 　　2.2 不同浓度Hyg对大葱愈伤组织分化的影响
　　由表2看出，随着Hyg浓度的增加及培养时间的延长，大葱愈伤组织死亡率逐渐升高，分化率逐渐降低。Hyg浓度为25 mg/L时，大葱愈伤组织培养40 d的死亡率达到21.7%，分化率极显著降低，仅为5%;浓度达到50 mg/L时，培养40 d的大葱愈伤分化率为零，而死亡率增至75%，是25 mg/L浓度时的3.5倍。可见大葱愈伤组织对Hyg特别敏感，适宜的选择浓度为50 mg/L。
　　2.3 不同浓度除草剂Basta对大葱愈伤组织分化的影响
　　分化培养基中添加除草剂Basta能明显抑制大葱愈伤组织分化产生不定芽。由表3可以看出，对照的愈伤组织培养10 d即开始分化产生不定芽，分化率为6.7%，培养20、30、40 d后的分化率分别为30.0%、43.3%、60.0%。大葱愈伤组织对除草剂Basta较为敏感，与对照相比，在添加0.05 mg/L Basta的培养基中培养20 d时，分化率降低至6.7%，培养40 d时则降至10%，死亡率升至23.3%。Basta 浓度为0.10 mg/L 时，愈伤组织再分化完全被抑制，并且死亡率升高明显，培养40 d时达到60%。由此可见，0.10 mg/L的除草剂Basta可作为大葱遗传转化愈伤组织分化的选择压浓度。
　　3 讨论与结论
　　为了初步筛选转化体与非转化体，植物遗传转化的质粒上通常带有筛选标记基因，通过外界设置产生选择压力能够有效地抑制非转化体生长。Kana抗性基因是第一个转化到植物中的标记基因，是植物转化中最常用的筛选标记基因。目前已大规模应用于番茄、油菜、辣椒、拟南芥等植物的遗传转化中。Hyg抗性基因，在某些作物上选择效率比Kana抗性基因高，在水稻中应用较多。除了抗生素抗性基因，抗除草剂基因也常常用于转基因标记[13]。因此，本试验选择Kana、Hyg以及Basta（Bar基因）作为大葱遗传转化中愈伤组织分化抗性选择剂，再从中进行筛选。
　　Kana抗性基因在葱属植物中的应用相对较少。徐启江等[6]认为洋葱遗传转化中，Kana作为抗性选择剂的适宜浓度为150 mg/L。但也有研究表明，Kana不适宜作为葱属植物遗传转化的抗性选择剂。Wilmink等[14]认为基于Kana抗性建立起来的选择系统通常不适用于单子叶植物，因为它们的细胞和组织对Kana相对不敏感;Eady等[3]对洋葱遗传转化研究表明，当Kana浓度达到200 mg/L时，与对照相比仅有15%的影响，可见洋葱愈伤组织对Kana并不敏感;Park等[7]在利用基因枪转化大蒜愈伤组织的研究中发现，大蒜愈伤组织对Kana的耐受性比较强。本研究结果也表明，当Kana达到100 mg/L、培养时间为40 d时，愈伤组织死亡率仅有6.7%，可见大葱愈伤组织分化对Kana抗性并不敏感。
　　葱属植物遗传转化利用Hyg作为抗性基因的研究相对较多。Eady等[3]通过对洋葱遗传转化选择压的研究表明Hyg水平在50～100 mg/L时比较适宜;Zheng等[15]在做大蒜遗传转化时，利用25 mg/L Hyg作为选择压;Kondo等[8]在大蒜茎尖分生組织转化研究中的结果表明，Hyg浓度从10～40 mg/L逐渐增加，逐级筛选转基因植株的效果最佳;Park等[7]在基因枪转化大蒜愈伤组织的研究中发现，大蒜愈伤组织对Hyg的筛选比较敏感，未转化的愈伤组织在含有50 mg/L Hyg的培养基上生长2个月后死亡;唐巧玲等[10]通过对未转化的大蒜愈伤组织进行Hyg耐受性测试，结果表明Hyg浓度在50～70 mg/L 时进行愈伤组织的筛选比较适宜;Zheng等[4]研究洋葱和青葱的遗传转化时推荐Hyg的选择压浓度为50 mg/L。对于大葱遗传转化的研究仅有1篇报道：杨俊杰[11]通过对大葱遗传转化时愈伤组织分化对Hyg 的抗性研究表明选择压为50 mg/L时比较适宜，本研究结果与此一致。说明大葱愈伤组织对Hyg的选择压力比较稳定。
　　Basta是一种有机磷类除草剂，其有效成分是膦丝菌素（PPT）。它主要通过抑制谷氨酰胺合成酶（GS）活性，使植物体内氮代谢紊乱、细胞内氨含量过高而中毒，叶绿素解体，光合作用受到抑制，最终导致植物死亡[16，17]。由于Basta对植株的伤害相对较小[18]，同时能提高选择效率，比较适用于大规模的遗传转化研究[13]。现在很多遗传转化开始利用除草剂作为抗性选择基因。Eady等[3]通过对洋葱遗传转化选择压的研究表明，Basta水平在10～30 mg/L时比较适宜;Nada[13]通过对大麦和拟南芥的遗传转化研究表明，Basta涂刷大麦叶片的的适宜筛选浓度为7 mg/L;利用MS培养基筛选拟南芥的研究证实Basta的适宜添加浓度为7.5 mg/L;王慧中等[19]研究了除草剂Basta对6个水稻品种愈伤组织的生长和分化的影响，水稻愈伤组织在分化阶段对Basta相当敏感，品种之间差异较大，完全抑制愈伤组织分化的Basta浓度为2.5～3.0 mg/L。李倩等[20]通过对甘薯遗传转化抗性选择剂的研究表明川薯164与西成薯007叶片抗Basta的最适选择压均为1.0 mg/L。由以上研究可以看出Basta的使用浓度差异较大，这主要与使用方法以及作物不同有关。本研究表明，完全抑制大葱愈伤组织分化的Basta浓度为0.10 mg/L，达到0.25 mg/L、培养40 d的愈伤组织在分化培养基中完全死亡。可见，大葱愈伤组织对Basta相当敏感。
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