高通量质谱检测番茄秸秆好氧堆肥中关键微生物的功能

来源:用户上传      作者:张小梅　咸洪泉　李雅华　陈清华

　　 摘要：为深入研究堆肥过程中主要微生物的功能，以番茄秸秆为原料，对其反应器堆肥过程进行研究。通过反应器自动温度传感器记录堆肥温度，利用分光光度法测定堆肥过程中植物生物质降解相关酶活力，并对酶活力最高时期的典型代表性样品进行高通量Orbitrap质谱鉴定。结果表明，反应器堆肥共持续35天，其中50℃以上的高温期10天以上，发酵至第7天时，内切纤维素酶和木聚糖酶活力最高。对该时期样品进行质谱鉴定发现，Thermobifida是主要的功能细菌，且是唯一的纤维素降解者，产生糖苷水解酶（GH）5家族和GH9家族的5种内切纤维素酶和3种GH48家族的外切纤维素酶。Planifilum产生GH3家族的β-葡萄糖苷酶，与Thermobifida一起将纤维素降解成葡萄糖。Thermobifida、Planifilum、Saccharomonospora、Aspergillus和Thermomyces共同参与木聚糖的降解，前三者为功能细菌，主要分泌GH10家族的木聚糖酶，后二者为功能真菌，主要分泌GH11家族的木聚糖酶。
　　关键词：堆肥;糖苷水解酶;功能微生物;高通量质谱
　　中图分类号：S141.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2020）04-0073-06
　　Abstract To further identify functions of key microorganisms in composting， the reactor composting process using tomato straw as raw material was studied. The compost temperature was auto-monitored by the temperature sensor， and the spectrophotometric method was applied in determining activities of the lignocellulosic enzymes. The sample with the highest activity was selected as the typical representative for further identification by high-throughput Orbitrap-LC-MS/MS. The results showed that， the thermophilic phase with temperature >50℃ lasted for more than 10 days during the whole period of 35 days， and the activities of both endoglucanase and xylanase peaked on the 7th day. The Orbitrap analysis revealed that Thermobifida was the only cellulose degrader secreting five endoglucanases including members of glycoside hydrolase （GH） family 5 and GH family 9， and three cellobiohydrolases from GH48. Planifilum cooperated with Thermobifida in cellulose degrading to glucose by secreting β-glucosidase from GH family 3. Thermobifida， Planifilum， Saccharomonospora， Aspergillus and Thermomyces participated in xylan degrading. Xylanases produced by the former three bacteria were members of GH10， and those secreted by the latter two fungi were from GH11.
　　Keywords Composting; Glycoside hydrolase; Functional microorganism; High-throughput mass spectrometer
　　
　　 堆肥是一种处理固体有机废物的有效途径，是系列微生物相互协同、共同作用的结果[1]。堆肥工艺的优化、宏观参数的调控实际上都是为更好地促进好氧微生物的活性[2]。
　　 酶是堆肥发酵过程中微生物参与代谢活动的直接体现。酶活性越高，对应微生物参与的代谢活动越旺盛。检测酶活力的方法，常见的是分光光度法，它通过检测一定时间内底物的减少量或产物的增加量来反映酶活力的高低[3]，该方法简单快速、实用性强。然而，在由多种微生物组成的复杂生境（如堆肥、土壤）系统中，往往有多种微生物参与同一代谢过程。如在堆肥生态系统中，参与纤维素降解的微生物既有细菌，如Thermobifida，又有真菌，如Aspergillus[4，5]。因此，对于复杂生境而言，仅通过酶活力的测定无法真实表征微生物的代谢活动。
　　 宏蛋白质组（metaproteomics）是指特定时刻下，环境微生物所表达的所有蛋白[6]。因其直接以参与各种代谢活动的功能实体（functional entities）——蛋白质为研究对象，同时无需蛋白分离、可直接对混合样品中的全部组分进行分析，故可原位检测微生物的功能、更加有效地探明微生物的具体代谢过程[7]。宏蛋白质组学分析一般依赖质谱仪，尤其是近年来，高性能、高灵敏度新质谱仪（如LTQ-Orbitrap）的推陳出新为新一代宏蛋白质组学技术在复杂生境研究中的广泛应用开辟了新的视野[4，5，8]。 　　 基于此，本研究以番茄秸秆反应器堆肥为研究对象，通过基础理化性质和木质纤维素降解酶活力的监测，确定腐解效率最高时期的典型代表性样品，并对其进行质谱鉴定以检测胞外蛋白组成及丰度。这对进一步明确番茄秸秆堆肥过程中主要微生物的代谢功能具有重要意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 仪器与试剂
　　 仪器：LTQ-Orbitrap-LC-MS/MS（将Shimadzu高效液相色谱仪Prominence nano液相色谱系统和ThermoFisher线性离子阱质谱仪LTQ-Orbitrap Velos Pro ETD相偶联）、高速冷冻离心机、分光光度计、电热恒温水浴锅、冷冻干燥仪。
　　 药品和试剂：二硫苏糖醇（DTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三氯乙酸（TCA）、三氟乙酸（TFA）、盐酸胍、碘乙酰胺（IA）、乙腈、Trypsin、NH4HCO3、冰醋酸均购自Sigma。
　　 变性缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl，2.75 mmol/L EDTA，6 mol/L盐酸胍溶于10 mL超纯水中，调pH至8.1±0.1。
　　1.2 数据库与软件
　　 Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/），Proteome Discovered Software 1.4 （Thermo Fisher Scientific）质谱结果比对软件。
　　1.3 反应器堆肥试验设置
　　 从校试验田收集新鲜番茄秸秆，充分晾晒切成2～3 cm小段后，测定其pH值、有机质（OM）、总氮（TN）、碳氮比（C/N）;之后，据测定结果以玉米秸秆为调理剂，调节物料的C/N比值在20～30之间、含水率（MC）至50%～60%。准备好的物料装入直径为200 mm、高500 mm、有效工作体积为15.7 L的堆肥反应器内（反应器由一台200 W气泵供气，带温度和氧传感器，可自动测量堆肥温度、进气和排气中O2浓度）。盖好上盖，启动气泵通气，控制通风量为0.2 m3/（min·m3物料）左右。
　　 觀察并记录堆温的变化，当堆温由环境温度上升到60～70℃之后下降至接近环境温度不再变化时，终止通气。将物料取出，进行第一次翻堆，材料充分翻动、混合后再放回反应器中，盖好上盖，重新启动气泵通气。
　　1.4 取样
　　 堆肥试验共持续35天。从堆肥发酵之初（0天），每隔一周采用“五点取样法”采集堆肥样品，混合均匀后作为该时期样品。
　　1.5 酶活测定
　　 取各时期样品100 g，加入400 mL蒸馏水，4℃静置24 h 后纱布过滤，
　　8 000 r/min离心10 min，去沉淀留上清即得粗酶液。采用二硝基水杨酸（DNS）法测定各时期粗酶液的内切纤维素酶和木聚糖酶活性[9]。所有试验重复3次。以吸光度的平均值±标准差表征酶活性的高低。
　　1.6 质谱
　　1.6.1 样品预处理及上机 以1.5中测得的酶活力最高时期的典型代表性堆肥样品进行Orbitrap质谱鉴定。样品预处理流程详见图1[10]。肽段喷入质谱仪的电压为2 000 V，转移毛细管的温度为275℃，质荷比（m/z）和分辨率分别设为400和60 000，得到全扫描质谱。
　　1.6.2 生物信息学分析 查阅相关文献，初步明确已有文献报道的番茄秸秆堆肥过程中主要的细菌属和真菌属。从Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org）中下载优势属的fasta格式蛋白质组数据文件，形成质谱数据比对的参考数据库。用Thermo Proteome Discovered Software 1.4对质谱数据进行比对分析。错配阈值设为0.05。每个蛋白的Accession号唯一，Description描述了该蛋白的功能及其来源微生物，通过peptide spectrum matching （PSM）参数定量表征对应蛋白的丰度。
　　2 结果与分析
　　2.1 堆肥温度的变化
　　 堆肥反应器温度变化如图2所示。可以看出，堆温在开始的前7天内不断上升，至第5天时温度已高于50℃，进入高温期，至第7天时温度最高，为62℃，之后开始下降;50℃以上的高温期持续了10天以上，之后堆温继续降低，在第25天时下降到与室温基本相当。物料重新混匀后再次发酵，温度又有所上升，但最高温仍低于50℃，然后又很快下降到与室温相当，发酵结束。
　　2.2 酶活力变化
　　 检测了堆肥发酵过程中与秸秆类植物生物质降解最相关的两种酶——内切纤维素酶和木聚糖酶活力的变化，结果如图3所示。可以看出，发酵开始的第一周内这两种酶活力不断上升，至第7天时酶活力最高，OD550分别为0.52±0.03和0.73±0.04，之后酶活力开始缓慢下降;内切纤维素酶在二次发酵过程中，活力又小幅上升，但OD550也仅为最高酶活力时的60%左右。由于第7天时两种与秸秆类植物生物质降解最相关的酶活力最高，一定程度上表明该时期参与秸秆降解的微生物代谢活性最为旺盛，故选该时期样品作为典型代表性样品进行质谱鉴定，以探明秸秆降解过程中关键微生物的功能。
　　2.3 主要微生物和酶的鉴定
　　 通过查阅已发表的番茄秸秆堆肥相关文献[11-14]，初步明确黄杆菌属（Flavobacterium）、副球菌属（Paracoccus）、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）、糖霉菌属（Glycomyces）、马杜拉放线菌属（Actinomadura）、芽孢杆菌属（Bacillus）、喜热裂孢菌属（Thermobifida）、糖单孢菌属（Saccharomonospora）和清野氏菌属（Planifilum）共计11个细菌属，曲霉属（Aspergillus）、嗜热丝孢菌属（Thermomyces）、支顶孢属（Acremonium）和毛壳属（Chaetomium）共计4个真菌属，可能是堆肥发酵过程中的关键微生物。遂从Uniprot数据库中下载以上微生物属的蛋白质组序列信息作为质谱数据比对的参考数据库。比对后的质谱结果如见表1。 　　 可以看出，共鉴定到9种纤维素酶和6种半纤维素酶。其中，纤维素酶主要由两种细菌属——Thermobifida和Planifilum产生，也即纤维素的降解主要由细菌介导，这与Zhang等[5]的结果基本相符。半纤维素酶则主要由Planifilum、Saccharomonospora、Thermobifida、Aspergillus和Thermomyces产生。
　　 Thermobifida是主要的细菌属，该属下的种共产生了5种内切纤维素酶、3种外切纤维素酶和2种β-木聚糖酶。从PSM丰度来看，Thermobifida产生的内切纤维素酶主要隶属于糖苷水解酶（GH）5家族（A0A068CD09）和GH9家族（A0A147KMV8、Q08166），而外切纤维素酶多源于GH48家族（A0A147KIK5、A0A399G3Q0和Q47NH7）;产生的两种β-木聚糖酶属于GH10家族（A0A147KJ27和P74912）。综上可以看出，Thermobifida是番茄秸秆堆腐过程中的主要功能菌。除Thermobifida外，主要的细菌还有Planifilum和Saccharomonospora，前者通过产生GH3家族的β-葡萄糖苷酶（A0A1I2KE01）和GH10家族的β-木聚糖酶（A0A1I2PGX8）分别参与纤维素和半纤维素的降解，而后者仅通过分泌GH10家族的β-木聚糖酶（A0A1I5MI26）参与半纤维素的降解。
　　 功能真菌主要为Aspergillus和Thermomyces，二者均通过产生GH11家族的β-木聚糖酶（A0A3A2ZH61和O43097）参与半纤维素的降解。
　　3 讨论与结论
　　 以番茄秸秆为原料，对其反应器堆肥过程中的关键酶活性进行了研究。结果发现，50℃以上的高温期持续了10天以上，在第一周时木质纤维素酶活力最高。对该时期样品进行高通量Orbitrap质谱鉴定，结果表明，胞外蛋白主要被鉴定为源于Thermobifida、Planifilum、Saccharomonospora、Aspergillus和Thermomyces等功能菌。Thermobifida是唯一的纖维素降解菌，主要分泌的内切纤维素酶有GH5家族的A0A068CD09，GH9家族的A0A147KMV8、Q08166和GH6家族的P26222，主要的外切纤维素酶有GH48家族的A0A147KIK5、A0A399G3Q0和Q47NH7。Planifilum分泌GH3家族的β-葡萄糖苷酶（A0A1I2KE01），Thermobifida与Planifilum协同作用，将物料中的纤维素降解为葡萄糖。
　　 除此之外，功能细菌Thermobifida、Planifilum和Saccharomonospora还均分泌GH10家族的木聚糖酶（如P74912、A0A1I2PGX8和A0A1I5MI26）;而功能真菌，如Aspergillus和Thermomyces则主要分泌GH11家族的木聚糖酶（如A0A3A2ZH61和O43097）。研究发现，GH10家族的木聚糖酶更容易接触高取代度的木聚糖，而GH11家族的木聚糖酶因分子量较小、水解速率较快等原因在木聚糖浓度较低时更容易发挥作用[15]。二者的协同作用表现为在木聚糖浓度较低时，GH11家族的木聚糖酶首先将木聚糖降解成不含侧链取代基团的木寡糖，木寡糖进而诱导GH10家族木聚糖酶的产生[16]。由于GH10和GH11家族木聚糖酶最大的区别在于降解含有侧链取代基团的木聚糖时，GH10家族酶的最小降解产物为甲基葡萄糖醛酸取代的木三糖（MeGlcA2xyl3），而GH11家族的降解产物则为甲基葡萄糖醛酸取代的木四糖（MeGlcA2xyl4），后者可进一步被GH10家族的木聚糖酶降解为木三糖-4-邻甲基葡萄糖醛酸和木糖[17，18]。中间产物木三糖-4-邻甲基葡萄糖醛酸可被进一步转运到细胞内，诱导木糖苷酶等系列酶的产生，将木聚糖彻底降解[19，20]。以上结果不仅证明不同家族木聚糖酶间有协同作用，同时证明堆肥是细菌和真菌相互协同、共同作用的结果。
　　 需要说明的是，通过调研相关文献，找到丰度较高的微生物属，然后下载其蛋白质组以构建质谱数据搜索用的参考数据库，可以一定程度上探明主要微生物的功能。然而，该方法的关键是所建的参考数据库是否能够包含所有的功能微生物，也即搜索结果是否能真实反映全部微生物的功能。因此，在条件允许的情况下，更应该首先进行微生物的多样性分析，以进一步优化所建的蛋白参考数据库。
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