桑黄基因组DNA提取方法优化及分子鉴定
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作者:陈力群 谭晴晴 陈雪燕 刘利平 刘国霞 胡悦 范阳阳 刘艳艳 步迅 张全芳
摘要：本研究以桑黄为材料，筛选出一种快速直接提取子实体DNA的方法。利用CTAB法、试剂盒及硅珠DNA纯化技术分别对桑黄子实体基因组DNA进行提取，结果表明，硅珠DNA纯化技术的提取效果最好，试剂盒方法次之。经过PCR扩增和测序得到桑黄的rDNA ITS序列，通过BLAST比对及系统进化树构建，发现所检测的样品为哈尔蒂木层孔菌Phellinus hartigii。
关键词：桑黄;DNA提取;ITS;分子检测
中图分类号：S567.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2019）01-0018-05
Extraction Method Optimization and Molecular
Identification of Phellinus igniarius Genomic DNA
Chen Liqun 1，Tan Qingqing 2，Chen Xueyan 2， Liu Liping 3， Liu Guoxia 2，
Hu Yue 2， Fan Yangyang 2， Liu Yanyan 2， Bu Xun 2，Zhang Quanfang 2
（1. High School Attached to Shandong Normal University， Jinan 250014， China;
2. Bio-Tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China;
3. Shandong Academy of Agricultural Sciences Community Health Service Station of Quanfu Office
in Licheng District of Jinan City， Jinan 250100， China）
Abstract Using Phellinus igniariusas as research materials， a method for rapidly extracting DNA from Phellinus igniarius was screened. The genomic DNA of Phellinus igniarius was respectively extracted by CTAB method， DNA extract kit and silica bead DNA purification technology. The results showed that the extraction method of silica bead DNA purification technology was the best， and the kit method was the second. The ITS gene sequence of Phellinus igniarius was obtained by PCR amplification and sequencing. By the BlAST sequence alignment and the construction of phylogenetic tree， we found the detected sample was Phellinus hartigii.
Keywords Phellinus igniarius; DNA extraction; ITS; Molecular detection
桑黃（Phellinus igniarius）是一类珍贵的药用真菌的统称，又称桑臣、桑耳、胡孙眼、桑黄菇，素有“森林黄金”的美称[1]，最早记载于《药性论》中。传统中医中用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脐腹涩痛、脱肛泄血、带下、闭经等[2];现在医学研究中，具有抗癌、抗菌、抗纤维化、保肝等疗效[3]，是最近几年开发的一种多年生珍贵药用真菌。全世界锈革孔菌科有约470个名称，针层孔菌属有430个名称，我国目前报道的锈革孔菌科有106种，针层孔菌属有40种，其中针层孔菌属中桑黄家族主要有：火木层孔菌（Phellinus igniarius）、针裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）、鲍姆针层孔菌（Phellinus baumii）等[4]。由于野生桑黄多生于松、杨、柳、桦、桃、栎树等阔叶树的枯立木或者树干上[5]，其子实体呈褐色马蹄形，大小不一，外观形态相似，很难依赖于形态特征进行鉴别，往往出现“同名异物”或“同物异名”的现象[6]。
随着分子生物学的发展，PCR技术[7]、RFLP[8]和RAPD[9]被逐渐应用于桑黄基源成分的鉴定。由于ITS序列具有种内菌株间相对保守，而种间差异比较明显的特点，非常适合真菌的物种鉴定和物种起源、多样性评价及亲缘关系的鉴定。因此基于rDNA ITS序列进行桑黄基源鉴定也成为首选方法，同时高质量DNA的提取也成为影响分子研究的关键。目前，桑黄主要是先进行子实体的分离、菌丝的培养，最后对培养菌丝进行基因组DNA提取。这样菌丝培养周期长，培养过程中存在污染问题。因此本实验室采用CTAB法、试剂盒及硅珠DNA纯化技术对桑黄子实体DNA进行直接提取，并通过PCR扩增和测序、BLAST比对及系统进化树构建，得出一种操作简便、DNA提取质量高、耗时短且费用低廉的优化方法，以便应用于桑黄物种鉴定、遗传分析等，为开展后续分子生物学试验奠定基础。 1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验桑黄样品购自当地药店。
1.2 仪器设备
主要有：7500 Real-Time PCR仪（赛默飞世尔科技公司）、紫外分光光度计SMA1000（北京美林恒通有限公司）、台式离心机5424R（德国Eppendorf）、ABI 3730xl DNA 测序仪（美国ABI公司）、Bio-Rad ChemicDoc TM XRS +凝胶成像系统、B960 PCR仪（杭州晶格科学仪器有限公司）等。
1.3 试剂
主要有：裂解液FP1、醋酸钾、洗涤液PW1，Proteinase K、硅珠、DNA Binding Buffer、75%乙醇、TE缓冲液、超纯水、EasyPure Genomic DNA Kit （TRAN公司）、Plant Genomic DNA Kit （TIANGEN公司）、EasyTaq Buffer、EasyTaq DNA Polymerase （北京全式金生物技术有限公司）。
1.4 基因组DNA提取
（1）方法A：根据文献[10]中CTAB方法提取桑黄子实体基因组DNA。
（2）方法B：参照TIANGEN真菌DNA提取试剂盒，具体提取方法参考说明书操作。
（3）方法C：将桑黄子实体表面用75%乙醇擦拭及超纯水冲洗2遍，称取样品50～100 mg用灭菌的研钵研磨，转入2 mL离心管后，加入500 μL裂解液FP1以及100 μL 醋酸钾振荡混匀，56℃裂解10 min， 12 000 r/min离心2 min;取上清于新的离心管中，加入2倍体积的DNA结合液和20 μL硅珠，充分混匀，12 000 r/min离心1 min，弃上清液;加入500 μL漂洗液进行洗涤， 12 000 r/min离心1 min，重复此步骤2次;加入 700 μL 无水乙醇，吹打悬浮，8 000 r/min离心1 min，弃上清液;8 000 r/min离心30 s，用10 μL枪头吸走残余液体，室温干燥10 min;加入50 μL TE缓冲液溶解DNA。
1.5 基因组DNA浓度和纯度检测
5 μL DNA提取液用2%琼脂糖凝胶，在150 V电压下电泳10 min后取出，溴乙锭染色，在凝胶成像仪上观察并拍照记录。另外，取2 μL DNA提取液，用紫外分光光度计测定其浓度以及A 260 和A 280 。
1.6 PCR扩增
PCR反应总体系为25 μL，其中EasyTaq聚合酶0.2 μL，10×EasyTaq Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 μmol/L）2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），DNA模板2.0 μL（20～50 ng/μL），ddH2O 补足至25 μL。PCR扩增上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[11]。PCR反应条件：95℃预变性3 min;95℃变性30 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸45 s，35个循环;最后72℃延伸10 min，16℃保存。利用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。然后将PCR产物切胶纯化，利用ABI3730XL测序仪进行测序。
1.7 数据分析
测序峰图利用SeqMan软件校对拼接，去除低质量序列及引物区，获得rDNA ITS序列。利用NCBI数据库中BLAST工具进行序列比对，对桑黄进行同源性分析。
1.8 系统进化树构建
从GenBank中下载18条桑黄菌株的rDNA ITS序列，利用MEGA 7.0软件采用Neighbor-Joining法构建系统发育进化树。
2 结果与分析
2.1 桑黄基因组DNA检测
分别取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果显示，方法A提取的DNA有条带，但有降解现象，而方法B和方法C提取的基因组DNA无条带（图1）。利用紫外分光光度计检测基因组DNA浓度和纯度（表1），可以看出，方法A的浓度明显高于方法B、C，但提取的DNA含有色素;方法A和B的A 260 /A 280 均存在比值小于 1.8 或大于2.0的现象，说明样品在基因组DNA提取过程中存在部分蛋白、酚类及RNA的污染。方法C的A 260 /A 280 比值在 1.8～ 2.0之间，浓度在50 ng/μL左右，可以满足后续分子生物学试验的要求。
2.2 PCR扩增及DNA测序
以三种方法提取的基因组DNA为模板，采用ITS引物进行PCR扩增，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现，方法B和方法C提取的DNA均能扩增出一条明显的特异性条带，分子量740 bp左右（图2）。DNA测序结果见图3。另外，利用NCBI数据库中BLAST工具对桑黄rDNA ITS序列进行比对，与Phellinus hartigii的同源性为100%，ITS序列见图4。
2.3 系统进化树构建
基于从GenBank中下载的18条桑黄菌株rDNA ITS序列，采用Neighbor-Joining法构建系统发育进化树（图5）。结果显示，检测样品與登录号为KY750527.1和JX093788.1的哈尔蒂木层孔菌（Phellinus hartigii）菌株亲缘关系最近，其序列相似度均为100%，因此初步鉴定检测样品为哈尔蒂木层孔菌。 3 讨论与结论
目前，桑黄基因组DNA提取主要是通过培养菌丝，然后利用传统的CTAB法或SDS方法进行提取。而菌丝的培养时间较长，一般需要3～7天，在培养过程中还会遇到其他菌类污染的问题。为了较快且准确地进行分子鉴定，获取高质量的DNA，本试验通过CTAB法、试剂盒及硅珠DNA纯化技术三种方法对桑黄子实体直接进行基因组DNA提取，并利用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳分析以及PCR产物扩增技术对三种方法提取的DNA浓度、纯度及后续分子生物学试验应用性等方面进行评估。方法A采用CTAB法，提取时间较长，且存在酚、氯仿等挥发性有毒物质，在提取过程中虽然获得的DNA产量较大，凝胶电泳可以看到明显条带，但是DNA溶液存在色素，影响后续PCR扩增。方法B采用试剂盒进行提取，获得的DNA产量小杂质少，但是价格相对偏高。而方法C采用硅珠DNA纯化技术，其纯度和浓度均能满足后续分子检测的需要，且PCR扩增条带单一。对方法B和C提取的基因组DNA PCR扩增产物进行测序及BLAST比对，并进一步构建系统进化树，结果显示检测样品与哈尔蒂木层孔菌（Phellinus hartigii）同源性最高，可确定为哈尔蒂木层孔菌。说明提取的桑黄基因组DNA可以满足后续的分子生物学试验要求，为桑黄物种的分子鉴定提供技术支持。在实际操作中，可以根據试验条件选择方法B（试剂盒法）或方法C（硅珠DNA纯化技术）。
参 考 文 献：
[1]孙培龙， 徐双阳， 杨开， 等. 珍稀药用真菌桑黄的国内外研究进展[J].微生物学通报， 2006， 33（2）：119-123.
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[4]刘春辉， 陈体强， 林跃鑫. 药用真菌桑黄的研究进展[J]. 菌物研究， 2004， 2（2）：53-59.
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