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运用组织培养建立藤茶快速繁殖体系的研究

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  摘要:以带芽的藤茶(Ampelopsis grossedentata)茎段为试验材料,研究藤茶组织培养过程中各个阶段的培养基和激素配比以及炼苗的基质配比。结果表明,藤茶组培苗的快速繁殖体系中,最佳初代培养基为MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L PVP;初代茎段培养愈伤组织的最佳基质配比为MS+4.0mg/L6-BA+2.0mg/L ZT+1.0mg/L NAA;藤茶芽的最佳增殖培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+2.0mg/LZT;最佳壮苗培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA;最佳生根培养基为NAA(0.1mg/L)+TBA(0.5mg/L),生根率可达到86.7%;炼苗阶段最佳移栽基质为泥炭十珍珠岩(2:1),并浇以改良霍格兰营养液,炼苗和移栽成活率可达73%。
  关键词:藤茶(Ampelopsis grossedentata);组织培养;快繁体系;培养基;成活率
  中图分类号:Q813.1+2;S567.23+9 文献标识码:A
  文章编号:0439-8114(2020)09-0171-06
  DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.037
  藤茶(Ampelopsis grosseclentata)在中国食用、药用历史悠久,由于人口清香、数日不馊,被称为“神茶”。据古代医典记载,其味甘性凉,可清热解毒,主治感冒风热、黄疽型肝炎、咽喉肿痛等[1-3]。目前研究证明,藤茶具有增强免疫力、抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、清热解毒等功效,且藤茶全株均可入药,主要功能性成分为黄酮、多酚、多糖等[4-8]。随着对其功能的不断认识,藤茶现已成为中国特有的一种茶用和药用植物。
  近年来,由于藤茶种植时间较长且种苗均采用扦插的方式得到,其品种退化较为严重,使藤茶的产量及品质均有所下降[9,10]。在长时间扦插繁殖后,需要用组织培养的方式对其品种进行复壮。关于藤茶的组织培养技术虽有报道[11,12],但是不成体系,重复试验显示效果不好。武芸等[13]于2009年对藤茶的愈伤诱导作用作了初步研究,达到了一定的效果,但没有成体系。本研究探索了藤茶的组织培养技术,旨在为藤茶的快速繁殖体系提供理论基础。
  1 材料与方法
  1.1 试验材料
  带芽的藤茶茎段。
  1.2 试验方法
  1.2.1 初代培养过程 取带芽的藤茶茎段,清洗干净后,用75%乙醇溶液泡35s,无菌水洗3次,将清洗过的材料进行消毒。进行初代培养40d后观察各组愈伤组织的情况并对相应的发芽率进行统计。
  经过预试验,将外植体接种到试验所研究的培养基上,4种培养基分别为MS培养基、1/2MS培养基、WPM培养基、N6培养基,在培养基中加入不同浓度的生长素,3种生长素分别为6-苄氨基腺嘌吟(6-BA)、萘乙酸(NAA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP),采用L16(44)设计正交试验,试验方案见表1。
  1.2.2 继代培养(芽的增殖培养)取初代培养中萌发的藤茶芽在培养基上进行继代增殖培养。在初代培养芽的基础上进行培养,这一阶段的培养基为MS基本培养基,探讨不同浓度激素处理对其生长的影响,3种激素为苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、玉米素(ZT),正交试验设计见表2。
  1.2.3 对培养苗进行壮苗处理在前一阶段的试验中,初代培养和继代培养虽然得出藤茶的芽,但是芽普遍比较赢弱、矮小。如果直接诱导生根,将会出现损失,在这一阶段需要对芽进行适当地壮苗处理,经过壮苗处理的芽更利于后续的培养。在这一阶段,进行壮苗培养的目的主要是促进茎的生长。
  在对培养苗进行壮苗处理的过程中,培养基为MS培养基,在MS培养基中添加不同浓度的6-BA和NAA进行调节,对两种调节剂的3个浓度进行正交试验,设计方案见表3,培养30d后进行观察并统计苗高和真叶数。
  1.2.4 诱导生根 通过前一阶段的培养,藤茶长出无根苗,在这一阶段对得到的无根苗进行生根处理使之长出不定根。诱导生根主要从不同的培养基和激素方面进行调节。将经过壮苗处理后得到的无根苗基部的愈伤组织和多余的叶片去除,移人生根培养基中。以4种不同的培养基及3种不同激素的4种浓度进行正交试验,试验方案见表4。
  1.2.5 生根后壮苗培养 由于前阶段培养基中生长素的浓度过大,得到的藤茶无菌苗生根后其顶芽的生长受到一定的抑制,植株生长缓慢。这一阶段將已经生根的无菌苗移入无激素的MS培养基中进行培养,培养时间为30d,主要目的是对苗进行壮苗处理,为下一步的移栽进行准备。
  1.2.6 炼苗及移栽 将试验中得到的生根苗移入相应的基质中进行炼苗处理,采用的基质为:①泥炭和珍珠岩进行混合(质量比为2:1);②全河沙;③红黄壤和河沙进行混合(质量比为2:1)。试验中所用基质在苗移人之前均进行高温高压消毒。
  移栽:对经过壮苗处理的生根苗进行清洗,移栽入装有基质的培养器皿中,浇足水,基质中以改良霍格兰营养液为营养成分,浇足营养液和相应的水后用薄膜进行覆盖,以确保培养基实时湿润。将经过壮苗处理的移栽苗放置于培养室中炼苗,观察其生长状况,并将成活小苗移栽,30d后统计成活率。
  1.3 培养基和培养条件
  所有培养基均加入6g几琼脂固化。初代培养过程中温度为2021℃,继代培养过程中温度为23~25℃。培养过程中的光照时间为每天12h,初代培养过程中的光照强度为1800lx,后续各阶段光照强度均为4000lx。
  2 结果与分析   2.1 初代培养
  2.1.1 藤茶茎段初代培养 在藤茶组织初代培养过程中,外植体为带芽的茎段,通过诱导其芽的萌发,得到相应无菌体系。接种10d后有愈伤组织形成,20d后芽开始萌动,30d后叶片开始萌发,通过观测不同的处理组,有的处理长势较好,有的处理开始有死亡趋势。
  通过正交试验法对初代培养过程中的培养基进行筛选,结果见表5和表6。由表5和表6可知,4种因素对藤茶茎段萌芽率的影响排序为:6-BA>NAA>PVP>基本培养基。由表6方差分析可知,6-BA和NAA对藤茶茎段荫芽率的影响均达到了显著水平(P<0.05),其余因素影响不显著(P>0.05)。在藤茶组织培养初代过程中6-BA和NAA是其主要影响因素。由表5可得最佳组合为2号,即MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L PVP为最佳初代培养基。
  2.1.2 藤茶茎段初代培养中愈伤组织的发生 藤茶茎段在初代培养过程中,在芽萌发的同时,芽基部的切口处普遍有愈伤组织的发生,各试验组愈伤组织的发生状况见表7。
  试验组4、7、8、13、16在培养基中处理后,数天后藤茶茎段死亡,不形成愈伤组织。在后续观察中,虽然试验组1、5、9、10、12萌发了大量的芽,但是愈伤组织较小。其他试验组都形成了愈伤组织,特别是试验组2和3,芽萌发率高,形成的愈伤组织也最大。不同的培养基培养造成愈伤组织的颜色、质地及愈伤组织量有明显差别。颜色从黄色、黄绿色到绿色,质地有的较疏松,有的则较致密。黄色和黄绿色愈伤组织的质地相对较疏松,绿色愈伤组织表面平滑且比较坚硬致密。从愈伤组织直径大小来看,2号培养基和6号培养基中的愈伤组织最多,但结合发芽率等因素,2号培养基比较适于藤茶茎段外植体愈伤组织的诱导。
  2.2 继代培养
  2.2.1 芽的增殖培养 藤茶芽的增殖培养试验结果见表8。由表8可知,在试验考察的3个因素中,6-BA对藤茶芽的增殖影响最大,其次为NAA,ZT的影响最小。由表9的方差分析可知,6-BA的浓度在藤茶芽的增殖培养中达到显著影响(P<0.05),其余两个因素的影响均不显著。由表8可知,最优组合为4,即MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+0.5mg/LZT。试验组4的平均增殖系数达到了3.47。
  2.2.2 愈伤组织的增殖培养 在愈伤组织的增殖培养过程中,通过观察得出,藤茶芽基部形成的愈伤组织大概可以分为两大类。第一类,愈伤组织表面光滑,绿色,质地密;第二类,愈伤组织表面光滑度较低,黄褐色或黄绿色,质地疏松。两种愈伤组织中第一类成芽较易,因此在后续试验中将這类愈伤组织扩大繁殖,以利于芽的增殖。
  2.3 壮苗培养
  初代培养和增殖培养过程中,芽的生长受到高浓度细胞分裂素的抑制,在进行中高浓度细胞分裂素培养后,在壮苗阶段紧接着进行低浓度激素的培养,可以调节植物细胞内的激素平衡,从而有利于植物生长及以后阶段的生根和移栽。
  经过初代培养和增殖培养2个过程处理后,芽的生长受到了一定程度的抑制,其原因为这两阶段中激素的浓度相对较高。因此,在壮苗阶段应采取低浓度的激素对其进行培养,使苗的顶芽得到生长,从而有利于生根、移栽以及以后植物的生长。
  藤茶壮苗培养试验结果见表10,分别对平均苗高和平均真叶数进行方差分析得表11和表12。由表11可知,BA和NAA的浓度对苗高的影响均达到了显著水平(P<0.05)。由表12可知,6-BA的浓度对真叶数有极显著影响(P<0.01),NAA浓度对真叶数有显著影响(P<0.05)。在平均苗高方面,5号组合(MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA)的效果最好;在平均真叶数方面,7号组合(MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)效果最好,但该组合的平均苗高太小,仅1.34cm。由于试管苗高是衡量试管苗质量的一个重要指标,因此应选择5号组合为最佳壮苗培养基。
  2.4 诱导生根
  表13为不同处理条件下藤茶无根苗的生根率,从表13中可以得出,不同生长素的种类和浓度对藤茶无根苗的生根率、平均生根数均有较大影响。
  2.4.1 基本培养基对藤茶生根的影响 4种基本培养基的生根率排序为MS>1/2 MS>WPM>N6。除MS培养基外,1/2 MS培养基的生根率也较高,但是MS培养基苗的长势明显比1/2 MS培养基好,因此,藤茶生根的基本培养基仍以MS为佳。
  2.4.2 生长素对藤茶生根的影响 IBA和NAA广泛应用于生根,当单独添加一种生长素时,0.1~1.0mg/L的NAA或IBA都可以诱导生根。在NAA的浓度为0.1mg/L、IBA的浓度为0.5mg/L时,生根率达到了86.7%。
  2.4.3 6-BA对藤茶生根的影响
  藤茶试管苗生根率和6-BA浓度呈现出负相关的关系,当6-BA浓度为1.5mg/L时,生根率为0。
  2.5 生根后壮苗培养
  由于较高浓度的生长素有利于根的生长,在生根培养过程中使用了较高浓度的生长素,但是在此浓度环境条件下芽的萌发受到抑制。在这种情况下如果直接移栽生根苗,苗的成活率可能会大大降低。因此,对生根苗进行壮苗培养很有必要,将生根苗移人无激素的MS培养基中,生长7d后生根苗长出新叶,14d后新叶片叶面积为老叶片的2倍。经过壮苗培养后对生根苗的生长具有明显促进作用,为后续移栽提高成活率奠定了基础。
  2.6 炼苗及移栽
  由表14可以看出,在最后的炼苗培养过程中,泥炭和珍珠岩混合作为炼苗基质能够显著提高移栽成活率,在试验考察的3种基质中效果最好,成活率达到73%。
  3 结论与讨论
  通过对藤茶带芽的外植体进行组织培养研究,得出藤茶组培快速繁殖从诱导生根到炼苗移栽的完整体系(图1),其主要结果为:   1)通过对培养基以及不同浓度生长激素进行研究,以L16(44)正交试验对初代培养基配方进行优化,得出最佳配方为MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L PVP。其中6-BA和NAA的浓度是影响藤茶茎段芽萌发的主要因素。
  2)藤茶带芽茎段初代培养过程中,在芽的基部普遍有愈伤组织的发生,但是最佳培养基组合为MS+4.0mg/L 6-BA+2.0m/L ZT+1.0mg/L NAA,且愈傷组织分化不定芽的能力强。
  3)通过试验得出,最佳增殖培养基配方为MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+2.0mg/L ZT,在此条件下增殖系数可达3.47。6-BA浓度为影响藤茶无菌芽增殖系数的主要因素。
  4)经继代培养的藤茶幼苗较弱小,需经壮苗培养再诱导生根。壮苗培养的最适培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。
  5)不同培养基、激素种类以及激素浓度对藤茶组培苗生根均有影响。培养基的选择上以MS培养基为最佳;激素浓度上,单独添加NAA和IBA都能诱导藤茶生根,但是最佳配方为NAA(0.1mg/L)+IBA(0.5mg/L),在此条件下藤茶组培苗生根率达到了86.7%。
  6)在生根培养后,虽然藤茶苗根部已经发育较好,但是整体植物较为赢弱,此时转入无激素的MS培养基中培养可以促进生长,为移栽打好基础。
  7)在移栽炼苗阶段,使用改良的霍格兰营养液保证营养,最佳的移栽基质为泥炭和珍珠岩相混合,其质量比为2:1,在此条件下炼苗及移栽成活率可达73%。
  目前组织培养技术日趋完善,近年甘蔗、梨、艾篙等农作物以及白芨等珍贵中药都有较为完整的组培繁殖体系报道[14-17],其愈伤组织诱导率达到80%以上,移栽大田成活率达60%以上,基本解决了种苗欠缺问题。虽然已有关于藤茶组织培养的报道[12,13],但始终停留在诱导愈伤组织上,没有得出完整的快繁体系。本研究建立了藤茶从诱导愈伤到大田移栽的整个体系,其愈伤诱导率达91.2%,移栽成活率可达73%,和其他植物的组织培养相比处于较高水平,对于藤茶生产具有积极意义。
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  收稿日期:2019-12-31
  作者简介:廖璐婧(1981-),女,湖北咸丰人,助理研究员,硕士,主要从事农业资源利用研究,(电话)13402709977(电子信箱)284372681@qq.com。
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