复方大黄净化液对慢性肾衰竭大鼠的治疗

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　　摘要：为研究复方大黄净化液灌肠对慢性肾衰竭大鼠的治疗作用，通过复制慢性肾衰竭模型，分为病理对照组、药用炭组、复方大黄净化液大、中、小剂量灌肠治疗组，用药周期为58d，测定了大鼠血清肌酐、尿素氮、尿肌酐、红细胞计数、血红蛋白含量及肾脏组织病理学变化。结果表明，复方大黄净化液各剂量组、药用炭组血清肌酐、尿素氮显著降低（P<0.05），且以复方大黄净化液大、中剂量组下降更为明显（ P<0.05）;复方大黄净化液各剂量组24 h尿肌酐显著升高（P<0.05），且以复方大黄净化液大、中剂量组更为明显（P<0.05）;复方大黄净化液大、中剂量组红细胞计数、血红蛋白含量显著提高（P<0.05）;灌肠后各剂量组可不同程度改善肾衰竭大鼠肾脏病理改变。复方大黄净化液对慢性肾衰竭大鼠肾功能、肾脏病理、贫血都具有一定改善作用，且存在量效依赖关系。
　　关键词：慢性肾衰竭;复方大黄净化液;血清肌酐;尿素氮;尿肌酐
　　中图分类号：R277.5
　　文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（ 2020 ）12-0121-03
　　D01：10.1408 8/j.cnki.issn0439-8114.2020.12.027
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　慢性肾衰竭（CRF）由许多肾脏疾病发展而来，呈慢性进行性肾实质损害，最终将演变成尿毒症，其病情危重、死亡率高，临床治疗非常困难。随着科学技术的发展，虽然人工肾及肾移植技术有良好的疗效，但费用高、技术难度大，难以普及使用[1]。
　　开发中医药疗法治疗本病是当前研究的热点，具有广阔的研究前景[2，3]。慢性肾功能衰竭的发病机制中包含虚实两个方面，肾气亏虚是其发病的根本，而浊毒内盛是标实之邪，中医药治疗慢性肾功能衰竭的关键是抓住早、中期。治之既要补益脾肾，治病求本，又当开通疏利，因势利导，使邪有出路，总结出“补肾与泻浊”“养血填精与活血化瘀”相结合的中医药治疗一体化方案，并结合临床实践，研制出了以泻浊为指导原则的复方大黄血液净化液用于结肠透析。
　　中药灌肠剂是指将中草药或中成药制成符合要求的水性、油性溶液或者混悬液，灌注于直肠以达到治疗、诊断或营养的目的[4]。中国很多古代医书都有关于中药灌肠剂治疗疾病的记载。《伤寒论》中就有“猪胆汁一枚，泻汁和少许法醋，以灌谷道内”的记载，实为最早的中药灌肠剂[5]。
　　体内的毒素大多是通过肾脏分泌尿液而排出体外，当肾脏功能下降时，则通过肾脏排出的毒素减少。由于肠道可以排出部分毒素，所以肾衰竭的病人，通过肠道排毒就成为非常重要的途径。中药灌肠治疗肾衰竭在中医院普遍使用，是中医药治疗重大疾病的一大特色，如治疗肾衰竭，并具有独特的优势[6，7]。结肠透析将现代科技与中医特色相结合，运用于临床以来取得了较好效果，在开展结肠透析时，运用广西中医药大学第一附属医院复方大黄净化液，经100例人次运用，无毒副作用，病人无痛苦，表明对肾衰竭期及氮质血症期病人尤为适用[8]。作为继血液透析和腹膜透析后的第三种透析方法，结肠透析以其安全、无创、低成本、疗效肯定、适应面广等治疗特点，正被愈来愈多的临床医师和患者所接受，将发挥其越来越重要的临床意义[9]。
　　中医灌肠疗法是中医干预CRF的特色疗法之一，系统评价证实中药灌肠可以延缓CRF的进展、减少其并发症[10，11]。但中医灌肠疗法在临床上多作为辅助疗法，很难排除其他疗法的干扰，临床证据级别较低，很难评价其确切疗效及开展深入研究。因此，本研究将临床观察证明疗效肯定的复方大黄净化液作为研究对象，开展其干预大鼠CRF的试验研究，以期评价其疗效，并为进一步研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 药物及试剂 复方大黄净化液：生大黄30 g、制附子15 g、桂枝15 g、煅牡蛎50 g、煅龙骨50 g、蒲公英45 g、土茯苓50 g，以上药材均购自广西一心堂药业，经广西中医药大学药学院中药教研室鉴定為正品，经水煎煮、过滤、水浴蒸发分别浓缩至每毫升含生药材0.68、1.5、2.8 g，即小、中、大3种浓度，置于4℃保存备用。药用炭片（批号：100812，规格：0.3 g/片，河北长天药业有限责任公司）。大鼠尿肌酐（UCR） Elisa试剂盒（批号：C019-2，南京建成生物工程研究所）、尿素氮（BUN）测试盒（批号：C019-3，南京建成生物工程研究所）、血肌酐（SCR）试剂盒（批号：C018-1，南京建成生物工程研究所）。
　　1.1.2试验动物SPF级SD大鼠，体量（200+20）g，购自广西医科大学实验动物中心，雌雄各1/2，单笼饲养于广西中医药大学第一附属医院动物实验室。大鼠在试验前于清洁级动物房适应性喂养5d，室温控制在（22±2）℃，相对湿度（65±2）%，自然光照射，大鼠自由摄食饮水，饲料为标准啮齿类动物饲料，饮水为纯净水。动物饲料、垫料均由广西医科大学实验动物中心提供。
　　1.1.3仪器 Modular-p800型全自动生化分析仪（美国Roche公司）;BX-50型显微镜（日本Olympus公司）;BSllOS型电子天平（德国赛多利斯集团）;En-Vision Xcite全波长多功能酶标仪（美国PerkinElmer公司）;LG16-W型高速低温离心机（德国Heraeus集团）;TCL-16B型和TCL-16C型高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;EL204型电子天平（梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司）;DW-86L490型超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）;代谢笼。
　　1.2方法
　　1.2.1模型复制取80只健康的SD大鼠，雌雄各半。按体重随机抽取10只作为空白对照组行假手术，其余70只参照施新猷等[12]方法进行模型复制，4周后检测大鼠尿肌酐含量。将造模成功的60只大鼠按体重随机分为5组，即模型组、药用炭组、复方大黄净化液大、中、小剂量治疗组。 　　1.2.2 给药于试验第7周，开始灌肠给药治疗，空白对照组、模型对照组大鼠去离子水灌肠;药用炭组大鼠给予0.3 mg/mL药用炭悬浮液灌肠;复方大黄净化液大、中、小剂量组分别用相应灌肠液灌肠，灌肠液体量为10mL/kg，均1次/日。灌肠前先将药液加温至37℃，给药周期为56 d。试验期间各组大鼠摄食、饮水量不限。灌肠方法：先在导尿管的头部做一个8 cm处的插入长度标记，然后用红霉素软膏涂抹记号以下部位的导管。取出大鼠，置大鼠头低尾高位，左手轻轻按住动物的头部和前肢，右手提起大鼠尾部露出大鼠的肛门，用左手将导尿管轻缓插入肛门8 cm，右手持5 mL的一次性注射器吸取适量的药液，轻轻推注到导尿管内灌肠。药物灌完后取适量去离子水将导尿管内的药物全部冲人直肠内，将导尿管在肛门内保留5 min后拔出，随后提着大鼠的尾部倒置抖动5 min，然后再放回鼠笼。
　　1.2.3 标本采集与检测试验结束前ld，代谢笼收集大鼠24 h尿液总量，用普通干燥管分别留取大鼠2 mL尿液，4℃静置th，3 000 r/min离心10 min，-50℃保存，Elisa法集中检测4h尿肌酐含量。水合氯醛腹腔注射麻醉，再行心包采血置于2 mL干燥管，4℃静置th，3 000 r/min离心10 min，-50℃保存。
　　苦味酸法检测血清肌酐，二乙酸一乙二酰肟法检测尿素氮、半导体激光流式细胞技术检测红细胞计数、阻抗一比色法检测血红蛋白。摘取各组大鼠右侧残肾，大体外观观察，用10%甲醛固定液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察肾脏组织结构形态学变化。
　　1.2.4 统计分析采用SPSS 21.0统计软件对数据进行完全随机设计的多个样本均数比较的单因素方差分析，试验数据均以均数±标准差表示。若差异具有显著性意义，则采用SNK-q检验进行多个样本均数间多重比较。
　　2 结果与分析
　　2.1 复方大黄净化液对大鼠血清肌酐、尿素氮含量的影响
　　与空白对照组相比，模型对照组、各治疗组中血肌酐、尿素氮显著升高（P<0.05）;与模型对照组相比，复方大黄净化液各剂量组、药用炭组血肌酐、尿素氮显著降低（P< 0.05）;与药用炭组相比，复方大黄净化液大、中剂量组血肌酐、尿素氮显著降低（P<0.05）（表1）。
　　2.2复方大黄净化液对大鼠24 h尿肌酐含量的影响
　　复方大黄净化液对大鼠治疗结束后，与空白对照组比较，模型对照组、各治疗试验组尿肌酐极显著降低（P<0.01）;与模型对照组相比，复方大黄净化液各剂量组尿肌酐显著上升（P< 0.05）;与药用炭组相比，复方大黄净化液大、中剂量组尿肌酐显著上升（P<0.05）;与复方大黄净化液小剂量组相比，复方大黄净化液大、中剂量组尿肌酐也显著上升（ P<0.05）（表2）。
　　2.3 复方大黄净化液对大鼠红细胞计数及血红蛋白含量的影响
　　与空白对照组相比，模型对照组、各治疗组红细胞计数及血红蛋白显著下降（P< 0.05）;与模型对照组相比，复方大黄净化液大、中剂量组红细胞计数及血红蛋白显著上升（P<0.05）（表3）。
　　2.4 复方大黄净化液对大鼠肾脏病理学的影响
　　空白对照组大鼠的肾小球、肾小管、肾间质大致正常，肾小球无硬化，肾小管无萎缩，肾间质无纤维化;模型对照组大鼠局灶肾小球硬化，肾小管萎缩，肾间质片状纤维化，伴淋巴、单核细胞浸润，部分小动脉亮变;复方大黄净化液大、中剂量组肾小球基本正常，肾小管空泡样颗粒变性，部分上皮细胞崩解脱落伴再生，肾间质无明显纤维化，血管正常，可见单核细胞及淋巴细胞浸润;药用炭组和复方大黄净化液小剂量治疗组与模型组无明显差别。
　　3 小结与讨论
　　CRF属于中医“关格”“溺毒”等病证范畴，中医学认为CRF早期以脾肾亏虚为主要病机，随着疾病的进展，产生了湿浊、溺毒等病邪，这些病理产物侵犯胃肠，导致胃失和降、小肠失于分泌清濁、大肠失于传导，临床上出现脘腹饱胀、纳呆、便秘、恶心、呕吐等消化道症状。同时，脾胃为人体气机升降之枢，这种胃肠功能紊乱持续存在，终将导致人体气机升降失调，而变生诸证。5/6肾切除模型的建立较简单、重复性好，是研究肾脏纤维化发生发展机制，延缓肾功能恶化的理想模型[13-15]。
　　血清肌酐、尿素氮、24 h尿肌酐定量、红细胞计数及血红蛋白及肾脏病理学改变等指标是反映CRF病情的重要指标。试验结果表明，模型对照组血肌酐、尿素氮显著升高，24 h尿肌酐定量显著升高，红细胞计数及血红蛋白显著下降，病理方面局灶肾小球硬化，肾小管萎缩，肾间质片状纤维化，伴淋巴、单核细胞浸润，部分小动脉亮变，说明模型复制成功。药用炭在降低血肌酐、尿素氮方面具有一定作用，其他方面无明显作用。复方大黄净化液各剂量组对上述异常指标都有不同程度改善，提示复方大黄净化液对于大鼠CRF确实具有综合的保护作用，其中以复方大黄净化液大、中剂量组改善明显，提示复方大黄净化液干预大鼠CRF具有一定量效依赖关系。本试验证明复方大黄净化液对CRF大鼠具有保护作用，为临床应用该疗法提供了依据，同时为进一步开展中医灌肠疗法的内在机制研究奠定了基础。
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　　基金项目：广西中医药大学第一附属医院院级科研项目（ 2017ZJ002）;广西科技厅重点研发项目（AB19110003）;广西壮瑶药工程技术研究中心开放课题（KJT1900105）;2019年广西中医药大学青年基金项目（2019QN036）;2019年度广西高校中青年教师科研基础能力提升项目（2019KY0341）;国家中医药管理局科研三级实验室中（壮）药化学与质量分析实验室项目（国中医药发2009[21]号）
　　作者简介：韦振源（1984-），男，广西象州人，主管药师，硕士，主要从事中药学的相关研究，（电话）18776728630（电子信箱）3444848285@qq.com;通信作者，龚敏阳（1970-），男，副主任药师，主要从事中药学的相关研究，（电子信箱）674632459@qq.com。
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