乌梅有机酸提取条件优化及其对生物膜形成的抑制作用

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　　摘要：对乌梅总有机酸的提取条件进行优化并研究其对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜产生的抑制作用。通过单因素试验及正交试驗对乌梅总有机酸提取条件进行了优化及验证，采用结晶紫染色法对金黄色葡萄球菌生物膜形成量进行了测定。结果表明，乌梅总有机酸最佳提取条件为乙醇70%（体积分数）、料液比3∶40（g∶mL）、超声提取时间1.5 h及超声提取温度50 ℃。在该条件下，乌梅总有机酸提取率为24.50%。提取物浓度为0.5MIC、MIC和2MIC时，对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制率分别为13.06%、48.24%和74.01%。因此，该提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有抑制作用。
　　关键词：乌梅;总有机酸;方法优化;金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）;生物膜
　　Abstract： The extraction conditions of total organic acid from Prunus mume was optimized and its inhibition on biofilm formation by Staphylococcus aureus was studied. The single factor and orthogonal test were used to optimize and verify the total organic acid extraction scheme of Prunus mume. The amount of biofilm formation by Staphylococcus aureus was determined by crystal violet staining. The results showed that the optimum extraction conditions of total organic acids were ethanol 70% （volume fraction）， solid-liquid ratio of 3 g / 40 mL， ultrasonic extraction time of 1.5 h and ultrasonic extraction temperature of 50 ℃. The extraction rate of total organic acid was 24.50% from Prunus mume under these conditions. The inhibitory rates on biofilm formation by Staphylococcus aureus was 13.06%，48.24% and 74.01% respectively at the extract concentration of 0.5MIC， MIC and 2MIC. Therefore， the extract could inhibit the formation of Staphylococcus aureus biofilm.
　　Key words： Prunus mume; total organic acid; method optimization; Staphylococcus aureus; biofilm
　　乌梅又称酸梅、干枝梅，由蔷薇科乔木植物梅（Prunus mume）的近成熟果加工处理所得。《本草纲目》及《本经》均有记载，乌梅的多数部分均可入药，主要可治疗呼吸系统疾病及胃肠道不适等。乌梅的化学成分复杂，主要包括有机酸、氨基酸、糖类及挥发油等[1]，丰富的化学组成赋予了乌梅多种功能。目前乌梅有机酸提取工艺以热水浸提居多，提取时间长，提取率较低。超声波在提取中的应用可以提高提取率，大大缩短提取时间。
　　细菌生物膜（Bacterial biofilm，BF）是细菌为自我防护而形成的膜状结构，最大特点是粘附性强，难以清除，从而导致持续性污染，成为食品安全的一大隐患[2]。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是造成人类食物中毒的常见致病菌，也可以引起人类和动物的化脓性感染，并具有很强的生物膜形成能力[3]。金黄色葡萄球菌作为第二大食源性疾病发病原因，对该菌有效控制具有非常重要的意义。本研究对乌梅总有机酸提取条件进行优化，并研究了该提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性和生物膜的抑制作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 菌株、材料和试剂
　　金黄色葡萄球菌保存于中国药科大学食品质量与安全实验室。
　　乌梅购于南京同和堂大药房，60 ℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，-20 ℃密封保存备用。
　　胰蛋白胨（生物试剂），购自北京奥博星生物技术有限公司;结晶紫草酸铵染色液，永安化学实验室出品;YEAST EXTRACT，购自Oxoid Ltd（UK）;酚酞，购自国药集团化学试剂有限公司。
　　1.2 仪器
　　HZQ-F160全温震荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司;UV-1800PC紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司;ELxTM800多功能酶标仪，美国博腾仪器有限公司;SB25-12DTD超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 乌梅总有机酸提取工艺流程 将一定质量的乌梅粉与不同体积分数的乙醇溶液置于50 mL锥形瓶中超声，冷却后离心（4 000 r/min、10 min），取上清液，旋转蒸发得浓缩液，定容后即为待测液[4，5]。
　　1.3.2 乌梅总有机酸提取率的测定 按文献[6]方法测定提取物中的有机酸，乌梅中的总有机酸含量以枸橼酸（Mr=192）计。按下式计算乌梅总有机酸提取率。 　　[总有机酸提取率=cVNaOH×Mrm×3×1  000×50×100%]    （1）
　　式（1）中，c为NaOH滴定液浓度，VNaOH为待滴定液消耗NaOH滴定液的体积，m为乌梅粉质量，3为枸橼酸与NaOH反应系数，50为稀释倍数。
　　1.3.3 乌梅总有机酸提取单因素试验
　　1）乙醇体积分数对提取效果的影响。取3.0 g乌梅样品，料液比为3∶40（g∶mL，下同），在45 ℃下水浴超声2 h，测定乙醇体积分数分别为60%、65%、70%、75%、80%时乌梅总有机酸的提取率[4]。
　　2）料液比对提取效果的影响。取3.0 g乌梅样品，在45 ℃下水浴超声2 h，测定料液比分别为3∶30、3∶35、3∶40、3∶45、3∶50（g∶mL）时乌梅总有机酸的提取率[4，7]。
　　3）超声时间对提取效果的影响。取3.0 g乌梅样品，恒定乙醇体积分数以及料液比，在45 ℃下水浴超声，测定超声时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h时乌梅总有机酸的提取率[4]。
　　4）超声温度对提取效果的影响。取3.0 g乌梅样品，恒定乙醇体积分数、料液比和超声时间，测定超声温度分别为35、40、45、50、55 ℃时乌梅总有机酸的提取率[4]。
　　1.3.4 乌梅总有机酸提取正交试验 在4个单因素试验结果的基础上，从每个单因素的5个水平中选取3个较好水平进行试验。以有机酸提取率为提取效果的衡量标准，采用4因素3水平的正交试验，按照L9（34）标准正交表进行正交试验设计，优化乌梅中有机酸的最佳提取条件[8，9]。
　　1.3.5 乌梅总有机酸提取工艺验证试验 按照正交试验优化后的工艺条件进行提取并计算有机酸得率[8]。
　　1.3.6 乌梅提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用 依据正交试验优化后的提取工艺进行提取，得100 mg/mL（以乌梅粉计）提取物，-20 ℃密封保存备用。
　　1）最低抑菌浓度（MIC）的测定。LB培养基灭菌后接种，加入提取液，使其终质量浓度分别为1.50、2.00、2.50 mg/mL，37 ℃ 150 r/min振荡培养24 h，观察金黄色葡萄球菌的生长情况。无菌生长的最低浓度组所对应的浓度即为MIC[3]。
　　2）对金黄色葡萄球菌生长的影响。LB培养基灭菌后接种，并加入提取物，使其终浓度为0.5MIC、MIC、2MIC，并设置空白对照组。37 ℃ 150 r/min振荡培养，分别在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h时测定其A600 nm的值，绘制生长曲线。
　　1.3.7 对金黄色葡萄球菌生物膜形成的抑制作用 培养基灭菌后加入5 mm×5 mm无菌输液管片，并加入提取物，使其浓度为0.5MIC、MIC、2MIC，并设置空白对照组，待冷却后接种菌悬液。37 ℃静置培养24 h，取出输液管片，无菌水冲洗，45 ℃干燥30 min，0.2%结晶紫染色3 min，无菌水冲洗其表面残余的结晶紫，45 ℃干燥30 min，放入96孔板，加入200 μL无水乙醇洗脱5 min，酶标仪570 nm测定洗脱液的吸光度值。按下式计算抑制率[2]。
　　[抑制率=A0-A1A0×100%]  （2）式（2）中，A0为空白组吸光度值，A1为实验组吸光度值。
　　2 结果与分析
　　2.1 乌梅总有机酸提取单因素试验结果
　　2.1.1 乙醇体积分数的确定 由图1可知，在乙醇体积分数为60%～65%时，乌梅总有机酸提取率呈上升趋势，且在乙醇体积分数为65%时提取率达到最高;但当乙醇体积分数大于65%时，乌梅总有机酸的提取率呈下降趋势。一方面可能与有机溶剂所具有的氢键的断裂有关，有机酸在植物体内与蛋白质、多糖等物质的连接方式常以氢键为主，因此复合体系有利于有机酸的提取;另一方面可能是乙醇分子与水分子之间作用力不同而造成提取出的主要有机酸不同，因而引起提取率下降。因此，选择体积分数为65%的乙醇溶液作为提取溶剂。
　　2.1.2 料液比的确定 由图2可知，在料液比为     3∶30～3∶35时，乌梅总有机酸提取率呈上升趋势。但在料液比3∶35～3∶45波动较小，当料液比大于    3∶45时，提取率呈下降趋势。当提取溶剂过少时，固液两相浓度梯度小，使固相中的有机酸物质不能完全溶出;而溶剂过多则有可能影响到超声波粉碎的效率，从而影响提取率。此外，料液比增大也会使旋转蒸发的时间延长。因此，选择料液比为3∶40。
　　2.1.3 超声提取时间的确定 由图3可知，在超声提取时间为1.0～1.5 h时，乌梅总有机酸提取率呈上升趋势，并在1.5 h处达到最大;在1.5～3.0 h时先下降而后趋于稳定。随着提取时间的延长，乌梅总有机酸的提取率应持续上升，但是在提取过程中可能会有空气进入提取液，进入的O2可能与有机酸发生一系列氧化、聚合等反应，导致乌梅总有机酸提取率下降。在实际生产中，提取时间的延长会导致生产成本增加。因此，选择最佳超声提取时间為1.5 h。
　　2.1.4 超声提取温度的确定 由图4可知，在超声提取温度为35～45 ℃时，乌梅总有机酸提取率呈上升趋势，并在45 ℃处达到最大值;温度大于45 ℃时呈下降趋势。随着水浴温度的上升，分子热运动加快，在温度较低范围内升温时，乌梅总有机酸提取率随温度升高而升高;但可能乌梅中的某些有机酸热稳定性较差，当温度超过45 ℃时，受热分解，导致乌梅总有机酸提取率下降。因此，选择最佳超声提取温度为45 ℃。
　　2.2 正交试验与结果
　　根据单因素试验结果，以总有机酸提取率为主要考察指标，采用L9（34）正交试验研究乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声提取时间（C）和超声提取温度（D）对乌梅总有机酸提取率的影响。 　　根据4个单因素试验的结果，设计了表1所示的正交试验因素与水平，其试验结果见表2。
　　根据表2中R（极差）分析可知，本试验所考察的影响乌梅总有机酸提取率的4个因素中，料液比（B）和超声提取时间（C）2个因素的影响较为显著，4个影响因素按照显著性从高到低依次排列为超声提取时间（C）>料液比（B）>乙醇体积分数（A）>超声提取温度（D）。
　　根据正交试验可知，乌梅中总有机酸提取的最佳条件为A3B2C2D3，即提取剂为70%乙醇溶液（体积分数）、料液比为3∶40、超声提取时间为1.5 h、超声提取温度为50 ℃。
　　2.3 验证试验结果
　　按照正交试验所确定的最佳提取工艺参数，使用提取剂为70%乙醇溶液（体积分数），料液比为3∶40（g∶mL），超声提取时间为1.5 h，超声提取温度为50 ℃，进行3次平行验证试验。结果表明，乌梅总有机酸提取率分别为24.43%、24.53%和24.53%，平均为24.50%，计算其相对标准偏差（RSD）结果为0.24%，表明利用正交试验对乌梅总有机酸的醇提工艺进行优化是有效的。
　　2.4 对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度（MIC）
　　由表3可知，乌梅醇提取物MIC值为2.50 mg/mL。
　　2.5 对金黄色葡萄球菌生長的影响
　　由图5可知，0.5 MIC（1.25 mg/mL）组在0～2 h生长速度趋近于空白组，但在2～12 h的生长速率与空白组有较为明显的差异，但其吸光度值在12 h时与空白组几乎无差别，并在24 h之后与空白组一样进入衰退期。MIC（2.50 mg/mL）组在12 h之前均处于缓慢生长状态，在12 h左右进入快速生长期，并在24 h时达到最高点。0.5 MIC组与MIC组随着培养时间的延长，抑菌物质被消耗，菌数趋同。由此上述2个浓度组的提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用表现在生长初期和进入对数生长期的时间被推迟及菌数所能达到的最大值降低，其抑菌作用在不同阶段呈现出不同的特性。2MIC组在0～48 h内细菌生长基本处于停滞状态。
　　2.6 对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响
　　由图6可知，乌梅醇提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有较为强烈的抑制作用，且其抑制程度随提取物浓度的增大而加强，提取物浓度为0.5MIC、MIC和2MIC时，金黄色葡萄球菌生物膜的抑制率分别为13.06%、48.24%和74.01%。
　　3 小结
　　通过单因素试验和正交试验，对超声法醇提乌梅总有机酸的工艺条件进行了优化，获得最佳提取条件为提取剂70%乙醇溶液（体积分数）、料液比   3∶40（g∶mL）、超声提取时间1.5 h、超声温度50 ℃。对该优化工艺条件进行验证，乌梅总有机酸提取率达24.50%，提取率较高，且提取时间短。抑菌试验结果显示，乌梅提取液对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为2.50 mg/mL。提取物浓度在0.5MIC、MIC和2MIC时对金黄色葡萄球菌生物膜产生的抑制率分别为13.06%、48.24%和74.01%，生物膜抑制率随着提取物浓度的升高而增大。因此该提取物对金黄色葡萄球菌生物膜的形成具有明显的抑制作用。
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