山银花叶中绿原酸的提取分离纯化方法研究
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摘要 本文以山银花叶为试验材料，通过正交试验优选出绿原酸最佳提取方法;使用大孔树脂对提取液进行粗分离，优化大孔树脂型号、上样液pH值、树脂对绿原酸的饱和吸附量及树脂洗脱条件;在乙酸乙酯纯化工艺中，考察萃取时间、萃取剂用量、萃取料液浓度、萃取次数，得到最佳萃取工艺。结果表明，在所确定的最佳提取、分离、纯化条件下，绿原酸纯度可达到95%以上（HPLC）。该提取分离纯化方法对山银花叶中有效成分绿原酸的提取率高、稳定性好，生产成本低廉，适用于工业化生产，是一种较好的高含量绿原酸提取物制备工艺。
关键词 山银花叶;绿原酸;提取;分离;纯化
中图分类号 R284.2 文献标识码 A
文章编号 1007-5739（2020）16-0195-03
Study on Extraction， Separation and Purification of Chlorogenic Acids from Leaves of Lonicera confusa
YUAN Yong-hong CHEN Zhi-yuan WANG Yu
（Jing Brand Chizhengtang Pharmaceutica Co.， Ltd.， Huangshi Hubei 435000）
Abstract The optimum extraction method of chlorogenic acid was selected by orthogonal test with Lonicera confusa leaves as the test materials. Macroporous resin was used to roughly separate the extract and optimize the type of macroporous resin， the pH value of sample solution， the saturated adsorption capacity of resin to chlorogenic acid and the resin elution conditions. In the purification process of ethyl acetate， the extraction time， the amount of extractant， the concentration of extractant solution and the extraction times were investigated， the best extraction process was got. The results showed that under the optimum conditions of extraction， separation and purification， the purity of chlorogenic acid could reach more than 95% （HPLC）. The extraction， separation and purification method had high extraction rate， good stability， low production cost， and was suitable for industrial production. It was a better preparation process of chlorogenic acid extract with high content.
Key words Lonicera confusa leaves; chlorogenic acid; extraction; separation; purification
山銀花名大银花，为忍冬科植物灰毡毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）、红腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）、华南忍冬（Lonicera confuse DC.）或黄褐毛忍冬（Lonicera fulvotomintosa Hsu et S. C. Cheng）的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒，疏散风热的功效，用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒及温热发病等[1]。山银花中含有挥发油、黄酮类、有机酸、酯类等多种化学成分[2-4]。其主要有效成分是绿原酸，是一种苯丙素类化合物，该成分易溶于水和乙醇。研究表明，绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗癌、抗白血病、降脂、降糖等作用[2-4]。近年来，山银花在医药、保健食品等领域的消耗量逐年增加，市场供不应求，但其茎叶未得到有效利用，造成较大的资源浪费。研究表明，山银花茎叶中也含有丰富的绿原酸，可作为提取绿原酸的原料[5-6]。目前，绿原酸的提取方法主要有水煎煮、回流醇提、微波提取、闪式提取、超临界萃取等[7-10]。虽然微波提取、闪式提取、超临界萃取等方法较优于常用的回流提取、水煎煮方法，但是这些设备价格比较昂贵，适合大型生产的设备不多，在实际生产中应用较少。本研究以山银花叶为原料，设计了水和乙醇提取绿原酸的工艺优化试验，使山银花叶中的绿原酸被充分提取出来，利用常用到的大孔树脂结合乙酸乙酯萃取方法对提取液进一步分离和纯化，最后通过结晶和重结晶使绿原酸纯度达到95%以上（HPLC）。建立了一种生产成本低廉、易操作、无毒无害、适用于工业化生产的高纯度绿原酸提取制备工艺。 1 材料与方法
1.1 试验材料
1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）、XS105型电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）、JJ1000A型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）、N-1300型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）、HH-4型恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。
AB-8大孔树脂、D101大孔树脂、LS303大孔树脂，购自陕西蓝晓科技有限公司;绿原酸对照品，购于中国食品药品检定研究院;山银花叶，购于湖北正光九资河药业公司;食用酒精，纯净水。
1.2 试验方法
1.2.1 绿原酸含量测定方法。 样品中绿原酸含量均参照《中国药典》2015版“金银花含量测定”项的方法进行。色谱条件：C18柱，乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）为流动相，检测波长327 nm。
1.2.2 正交试验法提取绿原酸。选择提取溶剂、提取温度、提取时间、提取溶剂倍数为考察因素，提取次数固定为2次，选择4因素3水平正交表进行正交试验，选择最佳提取条件。试验因素及水平见表1。
1.2.3 大孔树脂吸附分离绿原酸。1BV表示1倍柱体积，1BV/h表示1 h 1倍柱体积。
（1）大孔树脂的预处理。将大孔树脂用95%乙醇浸泡4 h以上，去除杂质，湿法上柱，再用纯净水冲洗至流出液澄清且无乙醇味，待用。
（2）大孔树脂型号选择。分别称取AB-8型号、D101型号、LS303型号树脂各100 g，进行预处理，湿法装柱。取3份各50 g山银花叶在最佳提取条件下制备得到的提取液进行动态吸附，吸附流速为2.0 BV/h，收集流出液，测定其中绿原酸含量，计算比吸附量，公式如下：
比吸附量=（吸附前药液中绿原酸质量-流出药液中绿原酸质量）/树脂量
（3）上样液pH值的优化。分别称取AB-8型号树脂3份，每份100 g，按照1.2.3（1）中描述进行处理。分别取3份50 g山银花叶在最佳提取条件下制备得到提取液，将提取液分别调节pH值至3、5、7，以2 BV/h速度进行吸附，收集流出液，并测定其中绿原酸含量，计算不同pH值下树脂的比吸附量。
（4）AB-8樹脂对绿原酸饱和吸附量的优化。2组AB-8型号树脂预处理后串联使用，每组树脂装量为50 g，称取150 g山银花叶子按最佳提取条件提取，提取液调节pH值至3后过串联树脂，依次用4 BV水和20%乙醇依次洗脱，用乙醇解吸时2根树脂的解吸液分开收集，测定第1根解吸液中绿原酸含量，计算树脂最大吸附量为22.7 mg/g。
（5）洗脱溶剂的优化。称取100 g山银花叶按最佳提取条件提取，提取液调至pH值至3后过100 g AB-8树脂，依次用4 BV水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇洗脱，上柱、洗脱速度均为2 BV/h。
（6）洗脱溶剂用量的优化。称取100 g山银花叶，按最佳提取条件进行提取，提取液调节pH值至3后过柱，依次水洗脱、20%乙醇洗脱，洗脱液均每1 BV收集1次，测定各组中绿原酸含量。
1.2.4 乙酸乙酯对绿原酸的纯化。
（1）萃取溶液的配制。称取约20 g上述树脂分离纯化得到的绿原酸提取物，加水200 mL，使溶解得到萃取溶液。
（2）萃取时间的优化。量取1.2.4（1）中溶液10 mL/组于分液漏斗中，共5组，加入10 mL乙酸乙酯，萃取5、10、15、20、30 min，每组萃取2次，静置分层后收集上层乙酸乙酯相，合并2次有机相，测定有机相中绿原酸含量。
（3）萃取溶剂用量的优化。量取上述1.2.4（1）中溶液10 mL/组于分液漏斗中，共5组，加入5、10、20、30、40 mL乙酸乙酯，萃取2次，每次20 min，合并2次有机相，测定有机相中绿原酸含量。
（4）萃取原液浓度的优化。量取上述1.2.4（1）中溶液10 mL/组于分液漏斗中，共4组，其中2#、3#、4#组分别加入纯净水5、10、15 mL，再加入等量体积的乙酸乙酯萃取2次，合并2次有机相，测定有机相中绿原酸含量。
（5）萃取温度的优化。量取上述1.2.4（1）中溶液10 mL/组于分液漏斗中，共5组，分别在25、35、45、55、65 ℃水浴锅中萃取15 min，萃取1次，立即将溶液倒入分液漏斗中，测定有机相中绿原酸含量。
（6）萃取次数的优化。量取50 mL绿原酸浓度10 mg/mL的溶液，加入200 mL乙酸乙酯，25 ℃萃取20 min，共萃取6次，每次萃取得到的有机相单独收集并测定其中绿原酸含量，计算萃取率。
（7）结晶。将乙酸乙酯萃取得到的有机溶液挥干，加入纯净水进行结晶，用纯净水洗涤结晶3次，低温干燥到白色粉末。
2 结果与分析
2.1 正交试验法提取绿原酸
由表2可知，各因素对绿原酸提取率影响主次为提取温度>提取溶剂>提取时间>提取料液比，最佳提取条件组合为A1B2C2D1，即以绿原酸提取率为指标的最佳提取条件为用水作提取剂、80 ℃、提取1.5 h、料液比1∶18、提取2次。
2.2 大孔树脂吸附分离绿原酸
3种型号树脂的比吸附量分别为6.60、4.72、2.79 mg/g，故选择AB-8型号树脂。不同pH值下树脂的比吸附量分别为12.71、6.65、5.95 mg/g，故选择将上样液pH值调至3。由表3可知，结合绿原酸纯度及洗脱比，用20%乙醇洗脱较佳。由表4可知，水洗可除去部分杂质，但洗脱量太大也会造成绿原酸的损失，结合洗脱液颜色及浸膏量确定选用2 BV，20%乙醇下的绿原酸主要集中在前6 BV，故选用6 BV的20%乙醇洗脱。综上所述，AB-8型号树脂分离绿原酸的最佳条件为：上柱液pH值调至3，树脂对绿原酸的最大吸附量为22.7 mg/g，洗脱条件为先用2 BV水，再用6 BV 20%乙醇，吸附剂洗脱速度均为2 BV/h。 2.3 乙酸乙酯對绿原酸的纯化
如表5～9所示，乙酸乙酯萃取绿原酸的最佳萃取参数为：绿原酸溶液浓度为10 mg/mL，25 ℃下萃取3次，每次乙酸乙酯用量为4倍溶液体积，萃取时间为20 min，经验证绿原酸萃取率可达到95%。
3 结论与讨论
山银花叶中绿原酸的提取受多种因素的影响，本研究主要针对提取溶剂、提取温度、提取时间、料液比等4个方面对绿原酸的提取率进行了研究。结果表明，采用水为提取溶剂，80 ℃提取2次，每次提取1.5 h，山银花叶中绿原酸提取率最高，绿原酸转移完全。采用水提取方法所用溶剂为水，安全易得，不存在易燃易爆危险，成本相对低廉、环保。
在绿原酸粗品制备工艺中，使用常见的大孔树脂在弱酸性条件下对绿原酸进行分离纯化，该工艺利用了绿原酸是多羟基酚酸，在酸性条件下（pH值2～3）以分子形式存在、疏水性强、易被树脂吸附这一特点。在绿原酸精制工艺中，使用乙酸乙酯进一步纯化绿原酸，再用水进行结晶，绿原酸转移率高、纯度高、乙酸乙酯和水安全性高、成本低廉。
总之，本方法以山银花叶为原料，采用水提取，大孔树脂分离，乙酸乙酯及水纯化和结晶，整个工艺生产原料价格低廉，易获得，安全性高，工艺简单，是制备高纯度绿原酸的优良方法，非常适用于工业生产。
4 参考文献
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作者简介 袁咏红（1986-），女，湖北黄石人，中级工程师。研究方向：天然药物化学。
收稿日期 2020-04-28
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