HPLC测定紫玉米中花青素的含量

作者:未知

  摘要    将紫玉米中的花青素经过酸化乙醇溶液超声加热提取,使花青素水解为一些常见的花色素。选用高效液相色谱仪,以1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,在530 nm波长处对飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素等6种常见花色素进行定量检测。结果表明,在浓度0.2~100.0 mg/L范围内,6种花色素浓度与响应值呈线性关系,分别获得标准曲线方程及相关系数,R2>0.99;6种花色素的平均回收率为88%~106%,相对标准偏差值为0.5%~3.9%。
  关键词    紫玉米;花青素;高效液相色谱
  中图分类号    O657.7+2        文献标识码    A
  文章编号   1007-5739(2020)17-0210-02                                                                                     开放科学(资源服务)标识码(OSID)
  Abstract    Anthocyanin in purple corn were extracted by ultrasonic heating in acidified ethanol solution and hydrolyzed into some common anthocyanins. Six common anthocyanins (delphinidin, cyanidin, petunidin, pelargonidin, peonidin, malvidin) were quantitatively detected at 530 nm wavelength by gradient elution using 1% formic acid solution and 1% formic acetonitrile solution as mobile phase. The results showed that in the range of concentration of 0.2 mg/L to 100.0 mg/L, there was a linear relationship between six anthocyanins concentrations and the response value, and the standard curve equation and correlation coefficient were obtained respectively, R2>0.99. The average recoveries of the six anthocyanins ranged from 88% to 106%, and the relative standard deviation values ranged from 0.5% to 3.9%.
  Key words    purple corn; anthocyanin; HPLC
  花青素是一类水溶性植物色素,可呈现红、蓝、紫等不同颜色。其广泛存在于植物的花、茎、叶以及果实中,花青素在自然条件下很少以游离状态存在,这一类水溶性植物色素常常与各种单糖通过糖苷键结合形成花色苷[1]。原花青素是目前世界上公认最有效的天然抗氧化剂,有效清除存在于人体内的自由基,恢复代谢平衡,具有美容、抗衰老和抗癌活性。基于这些功能,原花青素在很多领域都有着广泛的应用前景。紫玉米是含有酚类化合物(phenolic compounds)和花青素(anthocyanidins)的作物,因为具有一定的健康性和营养性,所以受到人们的關注。此外,紫玉米花青素还具有无毒、安全、药食兼用等特性,可作为一种天然色素,在食品工业、化妆品行业以及布匹染料等行业具有广阔的应用前景。在未来的研究中发展更多更好的花青素提取和检测方法,进而发挥出花青素的营养功效,可为人类的健康服务[2]。
  自然存在的花青素种类繁杂,常见的花色素有6种,分别是飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药色素、锦葵色素。目前,对紫玉米花青素含量的测定方法主要有紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法[3]等。花青素通过强酸水解可以转化成上述6 种常见花色素中的1种或几种。因此,总花青素含量可以通过分析花色素来确定。本试验运用高效液相色谱法测定紫玉米中花青素种类及含量,以期为紫玉米花青素的研究提供参考[4]。
  1    材料与方法
  1.1    试验材料
  试验药剂有:无水乙醇(优级纯),甲酸(色谱纯),甲醇(色谱纯),盐酸(优级纯),超纯水(密理博超纯水机过滤);芍药色素标准物质(纯度>97%),矢车菊色素标准物质(纯度>98%),矮牵牛色素标准物质(纯度>96%),锦葵色素标准物质(>97%),飞燕草色素标准物质(纯度>97%),天竺葵色素标准物质(纯度>96%),均购自北京索莱宝科技有限公司。   仪器与设备有:Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司),赛多利斯BAS124S电子天平(精度0.0001 g),纯水机(法国Millipore公司),高速旋风研磨机(德国IKA公司),MS3 basic涡旋混匀器(德国IKA公司),水浴锅(上海博迅实业发展有限公司),超声波清洗器(上海生析超声仪器有限公司)。
  1.2    试验方法
  1.2.1    标准溶液制备。分别精密称取锦葵色素、牵牛花色素、芍药色素、飞燕草色素、天竺葵色素、矢车菊色素6种标准物质各1.0 mg,分别用10%盐酸甲醇溶液溶解,并定容至5 mL,充分摇匀,配制成200 mg/L标准储备液,在-18 ℃条件下,贮存于密闭的棕色玻璃瓶中。
  1.2.2    样品前处理。将紫玉米用高速旋风谷物研磨机粉碎,准确称取5.000 0 g,置于50 mL具塞比色管中,加入酸化乙醇,定容至刻度,摇匀,超声提取30 min,然后置于沸水浴中水解1 h,取出冷却后,用酸化乙醇提取液再次定容。静置,取上层清液,用0.45 μm水相滤膜过滤,封入2 mL棕色进样瓶中,于4 ℃条件下保存待测[5-6]。
  1.2.3    色谱条件。色谱柱:Agilent-ZORBAXSB-C18(4.6 mm×250.0 mm,5 μm);流动相为1%甲酸水溶液(A)和1%甲酸乙腈溶液(B);流速为0.8 mL/min;柱温为35 ℃;检测波长530 nm;进样体积20 μL。梯度洗脱条件见表1。
  2    结果与分析
  2.1    标准曲线与检出限
  分别用10%盐酸甲醇溶液配制6种花色素的混标溶液,以峰面积(y)为纵坐标,以标准溶液质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线。如表2所示,6种花色素标准溶液的浓度在0.2~100.0 mg/L范围内与相应的响应信号呈现良好的线性关系。根据称样量1 g,定容体积50 mL,以3倍信噪比计算仪器检出限。根据标准物质的色谱分离定性,保留时间9.600 min的为飞燕草色素,保留时间11.550 min的为矢车菊色素;保留时间12.069 min的为矮牵牛色素,保留时间14.692 min的为天竺葵色素,保留时间15.529 min的为芍药色素,保留时间15.826 min的为锦葵色素(图1)[7-8]。
  2.2    稳定性试验
  取同一紫玉米样品提取液,按同样的色谱条件,将样品分别放置0、2、4、6、8、12、24 h后进行分析,结果发现,RSD值在0.4%~3.1%,这说明供试品溶液在24 h内稳定性良好,在24 h以上时部分花青素降解[9]。
  2.3    回收率和精密度
  分别向紫玉米空白试样中添加6种花色素的标准溶液,每种花色素的添加质量浓度各不相同,分别设计3个浓度水平,每个水平设计3个重复,与空白试样一同进行测定。结果表明,6种花色素的平均回收率为88%~106%,相对标准偏差为0.5%~3.9%,回收率、精密度均能满足检测要求[10]。
  2.4    样品测定
  应用以上1.2.2方法对紫玉米样品进行检测分析,结果见图2。结果表明,被检样品中含有4种花色素,分别为飞燕草色素(28 mg/kg)、矢车菊色素(830 mg/kg)、芍药色素(253 mg/kg)、锦葵色素(395 mg/kg)。其他2種色素未检出,所检测的紫玉米样品中总花青素的含量可达1 506 mg/kg。
  3    结论与讨论
  本研究建立了高效液相色谱法对紫玉米中6类花青素定量的方法。方法采用酸化乙醇溶液经沸水浴水解提取花青素。由于花青素在光照条件下易降解,因而在样品制备和检测过程中应尽量避光,以保证样品稳定性。样品采用安捷伦液相色谱仪,以1%甲酸水溶液和1%甲酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,在20 min内样品中花青素与干扰物有效分离,从而达到准确定量。通过添加不同水平的6种花色素标准溶液,证明本法精密度好、准确度高。该方法的建立为紫玉米产业发展奠定了理论基础,为紫玉米的开发和利用提供了数据支撑,同时也可为其他植物样中花青素检测提供参考。
  4    参考文献
  [1] 郝小琴,梁树辉,赵文涛,等.紫黑甜糯玉米花青素含量研究[J].现代农业科技,2019(15):21.
  [2] 刘炬.东北黑玉米花青素含量的测定[J].广东化工,2018(6):207.
  [3] 杨敏,孔青,陈丽媛,等.超声波辅助提取紫玉米花青素[J].食品科技,2015(6):269-274.
  [4] 杨敏.紫玉米花青素的提取纯化及稳定性研究[D].青岛:中国海洋大学,2015.
  [5] 贾士芳,董洪霞,董树亭.不同方法提取玉米花青素的对比研究[J].中国食物与营养,2011(8):58-61.
  [6] 岳喜庆,张超,王宇滨,等.双标样高效液相色谱法测定紫玉米花青素的含量[J].食品研究与开发,2010(6):126-129.
  [7] 王志广,张盟雨,易礼江,等.应用HPLC法对5种花色铃儿花花青素的定量分析[J].现代农业科技,2019(14):130-131.
  [8] 曹秀,余明霞,冯慧慧,等.高效液相色谱法测定黑枸杞中花青素的不确定度评定[J].河南农业科学,2019(6):152-160.
  [9] 杭园园,李悦,王朝警,等.黑果枸杞花青素类型、含量及结构分析研究[J].食品研究与开发,2018(13):143-148.
  [10] 胡莉,仲伶俐,毛建霏,等.高效液相色谱测定粮食、蔬菜和水果中的花青素[J].分析试验室,2012(12):43-47.
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