三种荚蒾中香豆素提取工艺及含量比较分析研究

作者:未知

  摘要:以皱叶荚蒾(Viburnum rhytidophyllum)、球核荚蒾(Viburnum propinquum)和鸡树条荚蒾(Viburnum sargentii)为原料,选取乙醇浓度、提取时间、提取温度和料液比为因素,吸光度为指标进行单因素试验,选取适当因素水平进行正交试验,并采用高效液相色谱法(HPLC)进行试验,采用优化后的工艺进行提取,比较3种荚蒾(Viburnum dilatatum)中香豆素的提取率。结果表明,3种荚蒾中均含有香豆素,其中,皱叶荚蒾中香豆素的含量最高,球核荚蒾次之,鸡树条荚蒾最少;皱叶荚蒾和球核荚蒾香豆素最佳提取条件为乙醇浓度55%、提取时间60 min、提取温度80 ℃、料液比1∶25(g∶mL);鸡树条荚蒾香豆素最佳提取条件为乙醇浓度55%、提取时间80 min、提取温度70 ℃、料液比1∶25(g∶mL)。不同品种荚蒾中香豆素的提取工艺和所提取的香豆素含量均存在差异。
  关键词:荚蒾(Viburnum dilatatum);香豆素;提取优化;测定比较
  中圖分类号:R284.2         文献标识码:A
  文章编号:0439-8114(2020)17-0107-05
  Abstract: The raw materials are Viburnum rhytidophyllum,Viburnum propinquum and Viburnum sargentii. The single factor experiment was carried out by selecting ethanol concentration, extraction time, extraction temperature and ratio of material to liquid as factors, absorbance as index, and then orthogonal test analysis was carried out at appropriate factor level and HPLC was used to carry out the experiment. The yield of coumarin from three varieties of Viburnum was compared by the optimized extraction process. The results showed that coumarin was found in all three kinds of Viburnum, Viburnum rhytidophyllum was the highest,Viburnum propinquum was the second, and Viburnum sargentii was the least. The optimum conditions of Viburnum rhytidophyllum  and Viburnum propinquum were as follows: The concentration of ethanol was 55%, the extraction time was 60 min, the extraction temperature was 80 ℃, and the ratio of material to liquid was 1∶25. The optimum conditions of Viburnum sargentii were as follows: The concentration of ethanol was 55%, the extraction time was 80 min, the extraction temperature was 70 ℃, and the ratio of material to liquid was 1∶25. The content of coumarin was different in the extraction process of different varieties of Viburnum.
  Key words: Viburnum dilatatum; coumarin; extraction optimization; comparison of measurements
  荚蒾属(Viburnum)植物在中国广泛分布,且西南部地区资源尤为丰富,一直以来都是重要的中药材。荚蒾属植物种类繁多且多数处于野生状态,具有抗尘埃和富集重金属能力,在适宜的园林中广为应用[1-3]。在现代研究中发现荚蒾(Viburnum dilatatum)有极高的药用和经济价值,其中有9种荚蒾的根、茎、叶及花果均可入药,且荚蒾中的有机成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等功效[4-8]。值得关注的是,荚蒾中的氨基酸和微量元素的营养价值较高且具有止咳疗效[9-12];其果实可用来制作果酱、饮品和酿酒,树皮纤维可制成绳索,因此,荚蒾的开发和应用非常有前景。荚蒾中主要含有多种天然活性物质,如类黄酮、糖类、酚类、香豆素和果皮红色素。已有研究对荚蒾中的黄酮、多糖、叶绿原酸和果皮红色素等天然活性物质进行了测定并提取分析[13-15],但尚未见到荚蒾中香豆素天然活性物质的提取研究。
  本研究以荚蒾属植物中球核荚蒾(Viburnum propinquum)、皱叶荚蒾(Viburnum rhytidophyllum)和鸡树条荚蒾(Viburnum sargentii)为研究对象,对这3种荚蒾叶中香豆素的含量进行测定并优化提取,同时对其叶中香豆素的含量差异进行比较分析,以期为保健品和化妆品提供更多的天然原料。   1 材料与方法
  1.1 材料与试剂
  皱叶荚蒾和球核荚蒾均采自湖北省恩施市土家族苗族自治州,北纬30°18′47″,东经109°16′4″,海拔1 420 m;鸡树条荚蒾采自湖北省恩施市土家族苗族自治州,北纬30°3′7″,东经109°6′53″,海拔1 130 m;香豆素标准品(CAS RN为91-64-5,纯度98%),购自成都埃法生物科技有限公司;无水乙醇(分析纯),购自北京化工厂;乙腈(色谱纯),购自科隆化学品有限公司;试验用水为去离子水。
  1.2 仪器与设备
  高速万能粉碎机(RT-02A),中诚药机;电子天平(BSA224S),赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;电热鼓风干燥箱(RT-02A),上海市博远实业有限公司医疗设备厂;低速大容量离心机(DL-5-B),上海安亭科学仪器厂;超声波清洗器(KQ5200E),昆山市超声仪器有限公司;循环水式多用真空泵(SHB-III),郑州长城科贸有限公司;高效液相色谱仪(LC7050),海能仪器股份有限公司;双光束紫外可见分光光度计(TU-1901),北京普析通用儀器有限责任公司。
  1.3 试验方法
  1.3.1 高效液相色谱法(HPLC)测定条件 Ultimate AQ-C18 (4.6 mm × 250 mm,5 μm),柱温35 ℃,流动相乙腈与去离子水体积比为45∶55,流速      1.0 mL/min,检测波长275 nm,进样量5 μL。
  1.3.2 供试品溶液的制备 选择新鲜的荚蒾叶,首先置于50 ℃恒温干燥箱内烘干,之后将干燥的荚蒾叶碎成粉末,然后过60目筛,称取干燥至恒重的荚蒾叶粗粉约5.00 g置于锥形瓶中,并放入超声波清洗器中超声30 min,分别在不同时间、不同浓度、不同料液比和不同温度条件下进行乙醇水浴提取,离心后低温保存。
  1.3.3 标准溶液的制备 精密称取香豆素标准品3.5 mg,加乙腈(色谱纯)定容至100 mL,即得浓度为35 μg/mL的香豆素标准溶液。分别吸取2、4、6、8 mL浓度为35 μg/mL的标准溶液于10 mL的容量瓶中,用乙腈(色谱纯)定容,分别配成7、14、21、28 μg/mL的香豆素系列标准溶液。
  1.3.4 3种荚蒾中香豆素吸光度值的测定 将所提取的3种荚蒾中香豆素稀释成不同浓度的待测液,用紫外分光光度计测定吸光度值,比较单因素中提取时间、乙醇浓度、料液比、提取温度3个水平的吸光度值大小。
  1.3.5 标准曲线的建立 在275 nm的波长条件下测定香豆素系列标准溶液,以标准溶液浓度X为横坐标,峰面积Y为纵坐标作标准曲线,得到线性方程Y=13.789X-4.308 5,R2 =0.999 6(图1)。
  1.3.6 单因素试验
  1)乙醇浓度。称取干燥至恒重的荚蒾叶粉末约5.00 g于锥形瓶中,置于超声波清洗器中30 min后进行水浴加热提取,在乙醇浓度分别为15%、35%、55%、75%、95%,料液比为1∶25(g∶mL,下同),提取温度为70 ℃,提取时间为70 min的条件下制备供试品溶液,采用紫外分光光度计测定样品吸光度,研究不同乙醇浓度对吸光度的影响。
  2)提取时间。称取干燥至恒重的荚蒾叶粉末约5.00 g于锥形瓶中,置于超声波清洗器中30 min后进行水浴加热提取,在提取时间分别为40、50、60、70、80 min,料液比为1∶25,提取温度为70 ℃,乙醇提取浓度为75%的条件下制备供试品溶液,采用紫外分光光度计测定样品吸光度,研究不同提取时间对吸光度的影响。
  3)提取温度。称取干燥至恒重的荚蒾叶粉末约5.00 g于锥形瓶中,置于超声波清洗器中30 min后进行水浴加热提取,在提取温度分别为40、50、60、70、80 ℃,料液比为1∶25,提取时间为70 min,乙醇提取浓度为75%的条件下制备供试品溶液,采用紫外分光光度计测定样品吸光度,研究不同提取温度对吸光度的影响。
  4)料液比。称取干燥至恒重的荚蒾叶粉末约5.00 g于锥形瓶中,置于超声波清洗器中30 min后进行水浴加热提取,在料液比分别为1∶10、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50,提取温度为70 ℃,提取时间为70 min,乙醇提取浓度为75%的条件下制备供试品溶液,采用紫外分光光度计测定样品吸光度,研究不同料液比对吸光度的影响。
  1.3.7 正交试验及含量测定 在单因素试验的基础上进行正交试验,以荚蒾中总香豆素提取率为考察指标,采用L9(34)正交试验设计,选取提取香豆素的最佳条件(表1)。
  将正交试验制备的样品溶液吸取约1 mL经0.45 μm有机微孔滤膜过滤,装样进行香豆素含量的测定,香豆素的提取率公式如下:
  [α=X×VM×10-5×100%]   (1)
  式中,α 表示香豆素的提取率,X表示样品液中香豆素的质量浓度(μg/mL),V表示提取液的总体积(mL),M表示荚蒾叶的取样质量(g)。
  1.3.8 验证试验及含量比较 对正交试验分析得出的最优组合进行验证。按照3种荚蒾品种分析得到的最优试验条件对样品中香豆素进行提取测定,分析计算香豆素的提取率,并在此基础上比较3种荚蒾中香豆素含量的差异。
  2 结果与分析
  2.1 单因素试验结果与分析
  分别在不同乙醇浓度、不同提取时间、不同提取温度和不同料液比4种因素条件下,对提取3种荚蒾中香豆素溶液吸光度的影响进行研究分析,结果如图2至图5所示。
  由图2可知,皱叶荚蒾和球核荚蒾中香豆素提取液的吸光度最大对应的乙醇浓度为55%,在此之前,吸光度随着乙醇浓度的增大而增大,当乙醇浓度大于55%时,吸光度开始减小,说明在试验范围内,皱叶荚蒾和球核荚蒾的最佳乙醇提取浓度为55%;而鸡树条荚蒾中香豆素提取液的吸光度呈先增大后减小、再增大、再减小的趋势,其最佳乙醇提取浓度为35%。可能原因是当乙醇浓度达到一定程度时,对香豆素的分子结构会造成不同程度的影响。   由图3可知,当提取时间在40~60 min时,香豆素提取液的吸光度随时间的延长而增大,当提取时间超过60 min 时,继续延长提取时间,3种荚蒾中香豆素提取液的吸光度反而减小,可能原因是长时间的超声机械作用使香豆素分子的某些键断裂,从而破坏分子,考虑到时间越长提取成本越高,所以提取时间宜选60 min。
  由图4可知,温度对皱叶荚蒾和鸡树条荚蒾中香豆素提取液的吸光度影响不大,而对球核荚蒾中香豆素提取液的吸光度影响呈先增大后减小的趋势,产生这一现象的原因可能是高温破坏了香豆素的结构。
  由图5可知,料液比对3种荚蒾中香豆素提取液吸光度的影响明显。吸光度随着料液比的增大而不断增大,但当料液比大于1∶25时,吸光度随料液比的增大而减小,因此,为了节约物料成本,选取料液比为1∶25提取较为合适。
  2.2 正交试验结果与分析
  分别取皱叶荚蒾、球核荚蒾和鸡树条荚蒾各5.00 g,每个品种各取9份,按因素水平表采用超声辅助水浴协同提取3种荚蒾的香豆素,以提取率作为考察指标进行正交试验,取平均值,结果见表2。极差R反映各因素对试验结果的影响,极差R越大,表示该因素对提取率的影响越大。根据K分析各因素水平对提取率的影响,K越大,表示因素水平对提取率影响越大,由此可得影响3种荚蒾提取香豆素的因素大小和最优提取组合。结果表明,皱叶荚蒾和球核荚蒾中香豆素的最佳提取条件为乙醇浓度55%、提取时间60 min、提取温度80 ℃、料液比   1∶25;鸡树条荚蒾中香豆素的最佳提取条件为乙醇浓度55%、提取时间80 min、提取温度70 ℃、料液比1∶25。影响皱叶荚蒾提取香豆素的因素大小表现为乙醇浓度>料液比>提取时间>提取温度;影响球核荚蒾提取香豆素的因素大小表现为乙醇浓度>提取时间>料液比>提取温度;影响鸡树条荚蒾提取香豆素的因素大小表现为提取时间>料液比>乙醇浓度>提取温度(表3)。
  2.3 验证试验及含量比较结果与分析
  按照3种荚蒾提取香豆素的最优组合进行3次平行验证,由表4可知,3种荚蒾的最优组合均能提取香豆素,但3种荚蒾所提取的香豆素含量差异较大,皱叶荚蒾中香豆素的含量最高,球核荚蒾次之,鸡树条荚蒾最少。
  3 小结
  通过单因素试验分别探索了提取时间、提取温度、料液比和乙醇浓度4个因素对荚蒾中香豆素提取率的影响,并在此基础上设计了正交试验,优化3种荚蒾中香豆素的提取工艺,对比分析不同品种、不同提取工艺的香豆素提取率。结果表明,皱叶荚蒾和球核荚蒾中香豆素的最佳提取条件为乙醇浓度55%、提取时间60 min、提取温度80 ℃、料液比1∶25;鸡树条荚蒾中香豆素的最佳提取条件为乙醇浓度55%、提取时间80 min、提取温度70 ℃、料液比1∶25。3种荚蒾中均含有香豆素,其中,皱叶荚蒾中香豆素的含量最高,球核荚蒾次之,鸡树条荚蒾最少。
  不同品种荚蒾中香豆素的提取工艺和含量存在差异,本研究为其他品种荚蒾中香豆素的含量测定和提取工艺奠定了基础。未来可收集不同地区的荚蒾屬品种,分析地区差异性对香豆素含量的影响,并对荚蒾属中香豆素的结构进行分析鉴定,建立荚蒾属香豆素高效液相特征图谱,以期为荚蒾属研究提供参考。
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