噬菌体对日本沼虾常见细菌性疾病的防治效果研究及其应用

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　　摘要：从3个日本沼虾（Macrobrachium nipponense）养殖池塘的水体、虾中分离得到41个菌株，经16S rDNA基因序列分析，结合菌落形态观察，水体分离到的菌株初步鉴定为芽孢杆菌属、气单胞菌属、肠杆菌属等，虾肝胰腺中分离的菌株初步鉴定为气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌科等。采用滴注法检测了噬菌体NTHP01对分离到的细菌的抑菌效果，结果表明，噬菌体NTHP01对芽孢杆菌、气单胞菌、不动杆菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、原生节杆菌、邻单胞菌、格氏乳球菌等均具有较好的裂解作用。将噬菌体NTHP01制剂在日本沼虾养殖塘进行示范应用，初步结果表明日本沼虾产量提高338～412 kg/hm2，产值提高2.25万～3.00万元/hm2。
　　关键词：噬菌体;日本沼虾（Macrobrachium nipponense）;细菌性疾病;防治
　　中图分类号：S945.1         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）17-0097-04
　　Abstract： 41 bacterial strains were isolated from water and shrimps of three Macrobrachium nipponense ponds， by 16S rDNA gene sequence analysis and colony morphology observation， the strains from water were preliminarily identified as Bacillus megaterium， Aeromonas caviae， Enterobacter roggenkampii，et al， the strains from shrimp were preliminarily identified as Aeromonas caviae， Citrobacter murliniae， Enterobacter roggenkampii， et al. The phage NTHP01 inhibition of bacteria was detected by drop injection methodthe results showed that， phage NTHP01 had good cracking effect on Bacillus， Aeromonas， Acinetobacter， Enterobacter， Citrobacter， Arthrobacter protophormiae， Orthomonad， Lactococcus garvieae， et al. Phage NTHP01 preparation was appliled in shrimp breeding pond， the preliminary results showed that， the yield of Macrobrachium nipponense increased by 338～412 kg/hm2， and the output value increased by 2.25 ten thousand ～3.00 ten thousand yuan/hm2.
　　Key words： phage; Macrobrachium nipponense; bacterial diseases; control
　　日本沼虾（Macrobrachium nipponense）俗称河虾、青虾，隶属于十足目（Decapoda）长臂虾科（Palaemonidae）沼虾属（Macrobrachium）。据渔业年鉴统计，2016年中国日本沼虾养殖总产量已达到27.26万t[1]，是中国产量较高的淡水养殖经济虾类之一。日本沼虾肉质鲜嫩、口感细腻，在上海、浙江、江苏等地广受消费者的欢迎。目前日本沼虾养殖过程中，最大的不利因素仍然是病害，养殖管理中稍有疏忽，极易暴发红体病、弧菌病、软壳症等细菌性疾病，给养殖户造成严重的经济损失。养殖户通常采用化学药物和抗生素进行养殖环境的改善和病害的控制，但化学药物的使用易对生态环境造成不良影响，抗生素的长期使用也会带来细菌耐药性、抗生素残留等负面影响。为了保护生态环境，提高水产品质量安全水平，抗生素替代药物的研发显得尤为重要。而噬菌体是一种可入侵细菌内繁殖，最终使细菌裂解的病毒，它可以“杀死”宿主菌，达到预防和治疗细菌性疾病的目的，又与细菌耐药性无关，是一种很有应用前景的抗生素替代疗法。农业部淡水渔业健康养殖重点实验室从中华鳖养殖塘中分离纯化获得1株噬菌体（NTHP01），前期已开展了生理特征和噬菌作用研究，为进一步拓展噬菌体在日本沼虾养殖中常见的细菌性疾病的防治作用，本研究开展噬菌体对日本沼虾养殖塘中分离细菌的抑菌试验，并在生产中示范应用，为后续在养殖生产中应用奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 日本沼虾、水样 试验用的日本沼虾、水样来自浙江省德清县下渚湖街道塘泾村、双桥村的3个日本沼虾养殖场。每个养殖场选择1个养殖塘，各随机采日本沼虾样品20余只，用采水器采集池塘近底层水样1瓶。
　　1.1.2 噬菌体 从中华鳖养殖塘分离得到的气单胞菌噬菌体（NTHP01），保存于农业部淡水渔业健康养殖重点实验室。
　　1.1.3 培养基 从日本沼虾、池塘水样中分离、培养细菌使用TCBS、TSA液体培养基、固体培养基。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细菌的分离 日本沼虾取肝胰腺，研磨匀浆，稀释10倍后取50 μL涂布于TCBS、TSA平板上，于30 ℃培养箱中培养16 h;水样稀释10倍后取     100 μL涂布于TCBS、TSA平板上，于30 ℃培养箱中培养16 h。观察平板上生长的菌落，根据菌落特征不同，分别挑取单个菌落接種于TSB试管中，30 ℃摇床培养18 h。 　　1.2.2 分离菌株的鉴定 按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取纯化菌株的DNA，将其作为模板进行PCR扩增。采用通用引物：27f：AGAGTTTGATCATGGCTCAG，1492r：GGTACCTTGTTACGACTT进行16S rDNA基因扩增，扩增体系50 μL：10×buffer      5 μL，dNTPs 8 μL，1.5 mmol/L MgCl2 4 μL，PrimerF  1 μL，PrimerR 1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，模板DNA 2 μL，dd H2O 28.5 μL。
　　PCR反应条件：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s、55 ℃复性1 min、72 ℃延伸2 min，30个循环;72 ℃温浴10 min。取5 μL PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，观察结果。PCR扩增产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定。将序列与NCBI开放数据库BLAST在线比对分析同源性，初步得出鉴定结果。
　　1.2.3 噬菌体抑菌效果试验 分离得到的菌株采用TSB液培养基，30 ℃摇床培养18 h，通过分光光度计测OD值，将菌液调整成合适的浓度（OD600 nm 1.0左右）;取适量实验室保存的噬菌体（NTHP01）液，离心取上清液，滤膜过滤。采用滴注法观察噬菌体的噬菌效果。各取菌液100 μL均匀涂布于整个平板，待平板表面风干3～5 min后，再在平板上滴加5 μL噬菌体液，30 ℃培养8～12 h观察噬菌效果。
　　1.2.4 噬菌体的示范应用 在浙江省德清县下渚湖街道塘泾村一日本沼虾养殖塘开展噬菌体制剂的示范应用。养殖塘面积约0.33 hm2，2018年7月5日放苗，放养密度为180万尾/hm2，7月30日开始使用噬菌体制剂，以2%～3%添加在饲料中拌匀投喂，每天投喂1次，按照连续投喂3 d—停喂5 d—投喂3 d的规程进行预防，如发现病害则加大使用剂量和频率;对照养殖塘不使用噬菌体制剂，传统模式管理。10月初开始陆续捕获商品虾，统计养殖产量。
　　2 结果与分析
　　2.1 细菌的分离纯化及鉴定结果
　　从日本沼虾养殖塘的水样中共分离到21个菌株（表1），经16S rDNA基因序列分析，结合菌落形态观察，初步鉴定为芽孢杆菌属、气单胞菌属、肠杆菌属等;从日本沼虾肝胰腺中共分离到20个菌株（表2），经16S rDNA基因序列分析，结合菌落形态观察，初步鉴定为气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌科等。
　　2.2 噬菌体对日本沼虾养殖环境中常见细菌的噬菌作用
　　对从青虾养殖塘水体和青虾中分离到的41个菌株进行噬菌体噬菌试验，结果表明噬菌体NTHP01对芽孢杆菌、气单胞菌、不动杆菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、原生节杆菌、邻单胞菌、格氏乳球菌等均具有较好的裂解作用（表1、表2）。
　　2.3 噬菌体的示范应用效果
　　在浙江省德清县下渚湖街道塘泾村一日本沼虾养殖塘开展噬菌体制剂的示范应用，经过一个养殖周期的应用，统计产量约为1 050 kg/hm2，产值12.00万～15.00万元/hm2;对照养殖塘由于发病等原因，产量很低，只有300～375 kg/hm2。与往年比较使用噬菌体的养殖塘产量至少增加338～412 kg/hm2，产值提高2.25万～3.00万元/hm2，且消毒剂和其他药物的使用量大大减少，示范效果良好。
　　3 小结与讨论
　　3.1 日本沼虾养殖中常见的细菌性病害
　　日本沼虾养殖中常见的细菌性疾病有红体病、烂鳃病、弧菌病、黑斑病、软壳症等[2]。叶雪平等[3]从患红体综合征（红体、红头）的青虾肝胰腺和肌肉中分离到菌株，经生理生化分析、药物敏感及感染试验等，鉴定为拟态弧菌。沈锦玉等[4]、薛晖等[5]从患红鳃病、红体病青虾的肝、肌肉、鳃中分离到菌株，均鉴定为嗜水气单胞菌 。潘晓艺等[6]从患软壳综合征的濒死青虾体内分离到一株细菌，经API32E系统鉴定及16S rRNA序列分析， 确定该病原菌为维罗纳气单胞菌温和生物变种，与维罗纳气单胞菌和维罗纳气单胞菌温和生物变种的同源性都为99%。本研究采样的日本沼虾池塘虽然没有发病，但从养殖水体、日本沼虾体内均分离到大量菌株，经鉴定为气单胞菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌科等，都是水产养殖中常见的致病菌，尤其气单胞菌属中的嗜水气单胞菌在一定条件下可引起青虾红体病，该病传染性强、发病面广、死亡率高[2， 3， 5]，危害很大。
　　3.2 噬菌体对病原菌的抑制作用
　　噬菌体以细菌为宿主，可以特异性地杀灭相应的宿主菌，是一种天然的抗菌生物制剂，对革兰氏阳性菌和阴性菌有裂解作用，特别对具有多重耐药性的病原菌都有较好的裂解效果[7-9]。Karunasagar等[10]从牡蛎组织和虾孵化场分离得到2个噬菌体，可以有效降低哈维氏菌群。Jun等[11]分离出2个噬菌体，发现对鱼类致病性嗜水气单胞菌均显示出有效的溶菌活性。本研究将从日本沼虾养殖塘水体和日本沼虾中分离到的41个菌株进行噬菌体噬菌试验，发现噬菌体NTHP01对芽孢杆菌、气单胞菌、不动杆菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、原生节杆菌、邻单胞菌、格氏乳球菌等均具有较好的裂解作用，农业部淡水渔业健康养殖重点实验室曾于2019年对水产养殖中常见的致病菌进行体外噬菌试验[12]，结果表明，噬菌体对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、副溶血弧菌、维氏气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等均有较好的裂解效果。
　　3.3 噬菌体在水产养殖中的运用
　　目前，噬菌体已成功应用于食源性致病微生物的防治，关于噬菌体在水产动物细菌性病害防控中的应用试验，国外科学家开展的研究比较多，用于治疗嗜水气单胞菌引起的泥鳅出血性败血病、哈维弧菌引起的斑节对虾发光弧菌病、对虾副溶血弧菌病、海参灿烂弧菌病等，均效果明显[13-15]。Le等[16]分离获得了2株嗜水气单胞菌噬菌体，应用在嗜水气单胞菌引起的条纹鲶大量死亡的有效性试验中，该噬菌体的保护率可达到100%，对照组的存活率仅18.3%。本研究将噬菌体应用在日本沼虾养殖中，按一定比例拌在饲料中定期投喂，初步的结果表明可降低日本沼虾发病率，跟对照养殖塘相比产量提高338～412 kg/hm2，增加經济效益2.25万～3.00万元/hm2。 　　綜上所述，噬菌体对日本沼虾常见病害的病原菌具有较好的抑制作用，在实际生产中应用效果明显。此外，噬菌体抑菌的作用机理是通过感染-繁殖-裂解循环周期杀灭细菌，与细菌是否耐药无关，而且特异性强，除对宿主菌外的其他细菌无杀伤力，对机体的正常菌群基本无影响，对人体、动植物、环境无任何毒副作用。噬菌体制剂对今后发展成水产养殖中的抗生素替代制剂具有很好的应用前景。
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