藜麦种子黄酮提取条件的优化

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　　摘要：为了探讨藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）种子黄酮的乙醇提取最佳条件，进而为藜麦黄酮的开发和高黄酮品种的筛选提供理论依据，采用4因素3水平正交试验设计，探讨了乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度对藜麦种子黄酮含量的影响。结果表明，各因素对藜麦种子黄酮提取含量的影响程度为乙醇体积分数>提取温度>料液比>提取时间。藜麦种子黄酮最佳提取条件为乙醇体积分数90%、料液比1∶50（g∶mL）、提取时间50 min和提取温度50 ℃。
　　关键词：藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）;种子;黄酮;提取条件
　　中图分类号：S512.9         文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）18-0103-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.020
　　Optimizing of extraction process of flavonoids from Chenopodium quinoa Willd. seeds
　　LAI Yun-ping1， LIU Xin-chun2， WANG Dan-dan1， YUAN Jin-e1， FENG Zong-yun2
　　（1.Chengdu Agricultural College， Chengdu  611130， China; 2.College of Agronomy， Sichuan Agricultural University， Chengdu  611130， China）
　　Abstract： In order to optimize the extraction process of flavonoids from Chenopodium quinoa Willd. seeds， as well as to provide theoretical basis for flavonoids exploitation and high flavonoids variety screening. Orthogonal design L9（34） test including four factors such as ethanol  volume fraction， solid-liquidratio， extracting time and extracting temperature was investigated. The results showed that the influence degree of each factor on extraction content of flavonoid from Chenopodium quinoa Willd. seeds were ethanol volume fraction> extraction temperature> solid-liquidratio> extraction time. The optimum extracting conditions were extracting reagent 90% of ethanol， 1∶50（g∶mL） of solid-liquidratio， 50 min of extraction time and 50 ℃ of extraction temperature.
　　Key words： Chenopodium quinoa Willd.; seed; flavonoids; extraction process
　　藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）又称南美藜、藜谷、印第安麦，为藜科藜属一年生双子叶草本植物，原产于安第斯山脉地区，有5 000多年种植历史，是安第斯山脉重要的粮食作物之一，被印加人称为“谷物之母”和“安第斯山的真金”[1]。藜麦具有非常高的营养价值，其种子富含蛋白质、不饱和脂肪酸、黄酮、B族维生素、维生素E、钙、铁、锌、铜、锰、镁、钾和硒等微量营养元素，而且含有人体所需的全部必需氨基酸，被联合国粮农组织认为是惟一的单一植物即可满足人体基本营养需求的食物[2]，美国国家航空航天局更是将藜麦视为人类未来移民外太空的理想“太空粮食”[3]。为了让世界关注藜麦的生物多样性和营养价值，让藜麦在粮食和营养安全方面发挥重要作用，联合国大会已将2013年设为国际藜麦年[4]。
　　黄酮是植物重要的次生代谢产物，具有抗病毒、抗炎、抗癌防癌、防止动脉粥样硬化、降血压、降血脂及胆固醇、抗氧化、防衰老等药理作用[5]。研究表明，藜麦种子含有丰富的黄酮类化合物，具体含量因品种而异，可达0.36～3.83 mg/g[6-8]。国内外报道了多种关于黄酮的测定方法，其中可见分光光度法简单方便，标准对照易得，结果可靠，是黄酮类化合物定量分析最常用的方法之一[9]。
　　关于藜麦黄酮提取工艺的研究已有不少报道。华艳宏等[7]分别采用不同溶剂提取藜麦种子的黄酮，认为70%乙醇是提取藜麦种子黄酮的最好溶剂。陆佳敏等[10]采用3因素3水平正交试验，确定藜麦的最佳提取工艺是乙醇体积分数70%， 提取时间0.5 h，料液比1∶40（g∶mL），各因素对黄酮提取效率的影响程度依次为提取时间>乙醇体积分数>料液比。孙雪婷等[11]认为各因素对藜麦黄酮提取效率的影响顺序为料液比>浸提时间>乙醇体积分数>浸提温度，最佳工艺是乙醇体积分数80%，料液比1∶30（g∶mL），60 ℃水浴温度下浸提60 min。董晶等[12]研究表明，藜麦种子黄酮的最佳提取条件为料液比1∶50（g∶mL），乙醇体积分数为80%，提取温度50 ℃，提取时间30min。董施彬等[13]研究表明，藜麦种子黄酮的最佳提取工艺为90%乙醇，温度90 ℃，料液比为1∶10（g∶mL），回流时间2 h。王丹丹[8]通过单因素试验研究表明，藜麦黄酮提取工艺最佳参数为80%乙醇、1∶50（g∶mL）料液比、70 ℃提取温度和60 min提取时间。上述结果表明，对于影响藜麦黄酮提取效率的关键因素已基本确定。本研究以青藜2号种子为试验材料，采用正交设计方法，探讨乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间对藜麦黄酮提取含量的影响，旨在确定各因素对藜麦种子黄酮提取效率的影响程度和最佳提取条件。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　供试材料为青海省农林科学院育成的青藜2号，保存于四川农业大学。对样品进行去杂，挑选颗粒饱满的种子，80 ℃烘箱内干燥12 h后，用粉碎机充分粉碎过60目筛，装入干燥器皿中备用。
　　1.2 主要试剂和仪器设备
　　主要试剂包括芦丁标准品、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化铝。主要仪器设备包括电热恒温鼓风干燥箱、研磨仪、分析天平、台式离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计。
　　1.3 藜麦黄酮提取正交试验设计
　　选择影响藜麦种子黄酮提取效率的主要因素，包括乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间4个因素为考察因子，根据前期研究的单因素试验结果和最适范围[8]，即乙醇体积分数为70%～90%，料液比为1∶30～1∶50（g∶mL，下同），提取温度50～70 ℃，提取时间为40～60 min，按照L9（34）正交表设计4因素3水平正交试验，具体因素和水平见表1。
　　称取500 mg藜麦粉末（设置3次重复），根据正交设计方案，加入乙醇溶剂，在相应的提取温度下浸提相应时间（具体温度和时间见表1），取出冷却后，6 000 r/min离心10 min，取上清液进行测定。
　　1.4 黎麦黄酮含量测定
　　标准曲线的制作参照陆佳敏等[10]的方法，即称取芦丁标准试剂5.0 mg，用体积分数为70%的乙醇完全溶解后定容至50.0 mL，摇匀，获得质量浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。分别吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只10.0 mL容量瓶中，加入質量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min后加入质量分数为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，放置6 min，再加入1.0 mol/L氢氧化钠溶液4.0 mL，用体积分数为70%的乙醇补至10.0 mL，混匀，以未加入芦定标准溶液的上述混合溶液为空白对照，于波长510 nm处测定其吸光度。以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品测定时，以样品提取液代替芦丁标准溶液。藜麦黄酮含量计算公式参考华艳宏等[7]的方法，即黄酮含量（mg/g）=C×V/M，式中，C为根据标准曲线得到的质量浓度（mg/mL），V为提取液的体积（mL ），M为样品质量（g）。
　　1.5 数据处理与分析
　　各因素对藜麦黄酮提取效率的影响程度采用直观法分析，处理间的方差分析采用SPSS 17.0软件进行。
　　2 结果与分析
　　2.1 芦丁标准曲线
　　芦丁在0～0.05 mg/mL质量浓度范围内，以吸光度（y）为纵坐标，芦丁标准品质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线（图1），得到回归方程y=12.23x-0.004（R2=0.999）。该结果表明，芦丁在该质量浓度范围内吸光度与质量浓度之间存在良好的线性关系。
　　2.2 正交试验结果的直观分析
　　采用直观法对正交试验结果进行分析（表2）。由表2可知，各水平组合对藜麦黄酮含量的影响较大，变幅为0.203～2.536 mg/g。各试验因素中，极差最大的为乙醇体积分数，其次为提取温度，再次为料液比，最小为提取时间，即对藜麦黄酮提取效率的影响程度大小顺序为乙醇体积分数>提取温度>料液比>提取时间。综合各因素的最优水平，初步确定藜麦种子黄酮提取的最佳工艺为A3B3C2D1，即90%的乙醇、1∶50的料液比、50 ℃提取50 min。
　　2.3 正交试验结果方差分析
　　为确定藜麦黄酮的最佳提取条件，以乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度为试验因素，藜麦黄酮含量为指标，以3次重复的试验数据进行方差分析（表3）。由表3可知，4个因素对藜麦黄酮提取含量的影响均达极显著水平（P<0.01）。
　　多重比较结果（表4）表明，随着乙醇体积分数的增大，藜麦黄酮含量升高，但乙醇体积分数为70%与80%的黄酮含量差异不显著，乙醇体积分数为70%与90%、乙醇体积分数为80%与90%的黄酮含量差异均达极显著水平（P<0.01），且乙醇体积分数为90%时黄酮含量最高。
　　随着料液比的增大，藜麦黄酮含量升高，且料液比3个水平间的黄酮含量差异均达极显著水平（P<0.01），其中，料液比为1∶50时提取的藜麦黄酮含量最高。
　　随着提取时间的增长，藜麦黄酮含量呈先增后减的趋势，提取时间从50 min增加至60 min的过程中，提取含量急剧下降，提取时间3个水平间的黄酮含量差异均达极显著水平（P<0.01），且提取时间为50 min时的提取效率最高。
　　随着提取温度的升高，藜麦黄酮含量呈先减后增的趋势，且60 ℃的提取效率远低于50、70 ℃，提取温度3个水平间的黄酮含量差异均达极显著水平（P<0.01），且50 ℃的提取效率最高。
　　2.4 最优条件的确定
　　综合正交试验的直观分析和方差分析结果，乙醇体积分数和提取温度为主要影响因素，料液比和提取时间影响程度次之，各因素的最优水平组合为90%的乙醇、1∶50的料液比、50 ℃提取50 min。
　　3 小结与讨论
　　以青藜2号藜麦为试验材料，通过正交设计方法，在不考虑互作的条件下，探讨了乙醇体积分数、料液比、提取时间和提取温度4个因素对藜麦种子黄酮提取的影响。综合直观分析法和方差分析结果，4个因素不同水平组合对试验结果均有显著影响，在编号2提取条件下，提取的藜麦黄酮含量为（2.536±0.2） mg/g，与编号4的结果相比，黄酮含量高达12.5倍，表明通过正交设计，探寻最佳提取条件非常有必要。本研究所得最佳提取条件，与孙雪婷等[11]采用热回流法最佳工艺和响应面分析法[14]最佳工艺的黄酮含量相当（分别为2.64、2.65 mg/g）。然而，王丹丹[8]同样以青藜2号为试验材料，采用超声波法提取藜麦总黄酮，结果表明，在最佳条件下，青藜2号的黄酮提取含量可达（3.07±0.09） mg/g，高于本试验提取条件下的黄酮含量，可见，超声波对藜麦黄酮提取的影响较大，因为超声波有利于细胞破碎，进而提高了提取效率。 　　对于乙醇体积分数，部分研究认为70%乙醇[10]或80%乙醇对于提取藜麦总黄酮的效果[11，12]为最佳，而本研究表明，70%和80%的乙醇体积分数对结果的影响未达显著水平（P>0.05），90%乙醇体积分数条件下的黄酮含量极显著高于70%、80%（P<0.01），与董施彬等[13]的研究结果相似，推测80%乙醇体积分数是提取黄酮含量显著提高的分界点，90%以上乙醇体积分数的提取效果如何有待进一步探讨，然而研究表明，乙醇体积分数过高则叶绿素等脂溶性物质的溶出量增多，不利于黄酮的提纯[15]，因此乙醇体积分数确定为90%相对较佳。提取时间对试验结果的影响较大，特别是从50～60 min，黄酮含量急剧降低，可能是随着提取时间的延长，部分黄酮降解[16]和提取液挥发导致[17]。多数研究表明，在低温范围内，随着提取温度的升高，黄酮提取含量升高，超过一定温度后，提取含量呈下降趋势，然而本研究发现，提取温度在60 ℃的提取含量极显著低于50、70 ℃，可能提取温度与其他因素存在较强的互作。
　　本研究表明，4个因素对藜麦黄酮提取含量的影响程度为乙醇体积分数>提取温度>料液比>提取时间，与程瑛琨等[18]研究鸡骨草和陈伟光等[19]研究葎草总黄酮提取的结论一致。多数研究表明，乙醇体积分数对提取黄酮含量的影响程度高于提取时间，料液比的影响程度高于提取时间，但乙醇体积分数与料液比的影响程度在不同试验条件下有差异。
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