乳酸菌的培养
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作者: 王庆起
摘 要:乳酸菌是发酵食品中应用最为广泛的细菌之一。基于其特殊的生理功能,在发酵工程中,首先要选育优良菌种,但由于微生物在自然条件下都是杂居混生的,因此要选育良种,就必须对其中的纯种微生物进行分离或鉴定。
关键词:乳酸菌 生理 鉴定
中图分类号:TS252.1 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2012)06(c)-0093-01
乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)是一类可发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌的总称,主要包括乳杆菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、链球菌及双歧杆菌等。
1 乳酸菌的生理功能
乳酸菌的生理功能主要有:(1)具有粘附性和定植能力。(2)产生抑菌活性的代谢产物。(3)降低胆固醇。(4)具有抗变异原性。(5)改善肝脏功能。(6)增强免疫功能。
2 乳酸菌的类型
乳酸菌大体上可分为两大类。一类是动物源乳酸菌,一类是植物源乳酸菌。
3 材料与方法
3.1 材料
3.1.1 样品
市售进口奶酪。
3.1.2 培养基
(1)MRS液体培养基:蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵1.45g、K2HPO4·H2O 2.6g、MgSO4·7H2O 0.58g、MnSO4·4H2O 0.25g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000mL。(pH 6.2～6.4,121℃,灭菌20min)。
(2)BCG培养基:A、B液灭菌后混匀。A液:脱脂奶粉50g,1.6%溴甲酚绿酒精液0.35ml,蒸馏水250ml.(90℃,开盖灭菌10min).B液:酵母膏5g,琼脂10g,蒸馏水250ml。(pH 6.8,121℃灭菌20min)A、B液灭菌后在无菌状态下混匀后倒平板。
3.2 方法
3.2.1 样品的处理
奶酪的处理:以无菌操作取奶酪1g,放入含有9mL灭菌加热至含40℃左右的生理盐水的灭菌广口瓶内,待奶酪溶解制成1∶10的均匀稀释液,并用无菌生理盐水逐级稀释至10-3、10-4、10-5。
3.2.2 乳酸菌的分离纯化
采用BCG牛乳培养基对稀释样品中的微生物通过平板倾注法进行分离纯化。以无菌操作取奶酪稀释液10-3、10-4、10-5各0.1mL置于灭菌后的平板中,加入15mL BCG牛乳培养基,带培养基凝固后放入恒温培养箱中,37℃恒温培养24h。观察结果稍扁平的黄色菌落,周围培养基变为黄色,初步定为乳酸菌。
3.2.3 菌种的扩大培养
配制MRS液体培养基,分装到试管中(每管约15mL),将选出的菌种接种到试管中在37℃条件下扩大培养24h,在接种到小三角瓶中扩大培养24h。
3.2.4 乳酸菌的鉴定
(1)形态学观察。
挑选出产抑菌物质的菌株,在合适的培养基上划线培养24h,待长出单菌落观察其菌落特征,在光学显微镜下观察其观察菌体形状、排列方式、有无芽孢等个体形态特征。
(2)生理实验。
①经固体培养基分离和液体培养基扩大培养的嗜热链球菌接种于脱脂乳中,在不同温度下培养发酵,结果嗜热链球菌在40℃左右时约需3h凝乳;在45℃以上,随着温度提高,凝乳时间延长；当培养温度大于55℃时,没有凝乳发生。当培养温度低于40℃时,随着培养温度的降低,凝乳时间延长；当温底低于25℃时,不能凝乳。
②将普通滤纸剪成约0.5cm～0.6cm宽的纸条,长度根据试管和培养基高度而定。用浓度为50～100g/L的乙酸铅将纸条浸透,然后置于烘干,放入培养皿或试管内,灭菌后备用。将新鲜试验菌培养物接种于培养液后,用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面,上端用棉塞塞紧。试验中设空白对照,在未接种的试管培养上悬挂乙酸铅纸条。另外接种已知菌的阴性反应作对照。置于37℃培养培养1d～3d,进行观察比较,纸条变黑为阳性反应。
(3)乳酸菌的保藏
将具有较强抑菌活性的乳酸菌活化培养,并加入一定的保护剂,在-76℃及真空下冻干3d后,放-20℃冰箱贮藏。
4 结果与分析
4.1 乳酸菌的鉴定
4.1.1 形态学观察(表1)
4.1.2 生理特征鉴定
根据生理生化实验结果,经过删选比对,菌株GL5的生理生化特性与干酪乳杆菌最相似。
5 结论
5.1 分离纯化结果
利用BCG培养基分离出市售干酪中单菌落,经观察菌落形态与革兰氏染色初步判定为乳酸菌。
5.2 鉴定结果
通过形态学观察与生理生化实验,菌株GL5初步鉴定为干酪乳杆菌。
参考文献
[1] 杨洁彬,葛兴华．乳酸菌生物学基础与应用[M]．北京:中国轻工业出版社,1996．
[2] 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999:6～16．
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