植物RNA病毒检测技术研究进展

来源:用户上传      作者: 刘湘宁 戴良英 董铮

　　摘要 RNA植物病毒常用的检测方法有生物学检测法、电子显微镜技术、血清学方法和分子生物学方法等，对这些方法的应用及其特点的研究进展进行了相应的总结，以期能够更好地运用这些方法，进行植物RNA病毒的检测与研究。
　　关键词 植物RNA病毒；检测技术；研究进展
　　中图分类号 S432.41 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）09-0150-03
　　Abstract Commonly detection methods of plant virus including biological assay，electronic microscopy，serological methods and molecular biology method. In this paper，the research progress of using and characteristics of these methods were summarized，in order to make better use of these methods，to detect and study plant RNA virus.
　　Key words plant RNA virus；detection technology；research progress
　　几乎所有植物，包括粮食作物、蔬菜、果树、经济作物、花卉和一些经济林木都在不同程度上受到病毒的侵染，而其中90%的植物病毒为RNA病毒。以前人们太重视病毒所带来的影响，除非造成大面积的流行或毁灭性的损失。病毒所造成的损失不仅是产量上，同时也伴随着质量的降低，无论是果实、叶片，还是工业所用材料的有效成分、花卉的商品价值等都受到严重的影响，降低其使用价值。因此，快速、灵敏、高效的检测病毒的方法成为认识和研究植物病毒病的重要手段。目前，植物RNA病毒的检测方法生物学检测方法、血清学检测法、分子生物学检测法等，这些方法各有优点，为现代常用的植物病毒病检测方法。现将这些方法的特点介绍如下。
　　1 生物学检测法
　　又叫指示植物检测法。1925年，James Johnson开始使用特殊的植物鉴定植物病毒[1]，植物RNA病毒一般都会有特别的鉴别寄主或者特定的指示植物。指示植物就是指能对某一种或某几种病毒及类病毒产生特异反应，被感染后能很快的表现出特异症状的植物[2]。因为指示植物的不同，可以细分为草本植物检测与木本植物检测。草本植物检测的植物如藜科、豆科、茄科以及葫芦科等植物都具有明显的指示作用，通常采用摩擦接种的方法进行检测，在严格的防虫隔离情况下进行摩擦接种，从而获得可靠的检测结果[3]。李春敏等利用黄瓜、南瓜等指示植物，对PDV、PNRSV在指示植物上的表现症状进行了检测与研究，检测出PDV。生物学检测法操作简单，准确程度较高，应用颇为普遍[4]。然而其特异性不太明显，存在一种病毒侵染后出现多种症状或多种不同病毒侵染后只出现一种表现症状的的现象。植物检测法检测速度缓慢，灵敏度较差，侵染指示植物后大多需要1～2周才有表现症状，个别甚至需要1～3年，而且受到植物生长与季节的限制，寄主的选择要求严格，维护植物的费用很高，特别的指示植物较难以得到。
　　2 电子显微镜检测法
　　从20世纪40年代建立了电子显微镜技术，Kausche和Melcher首次在电镜下看到TMV以来，电子显微镜技术已成为一种重要的植物RNA病毒鉴定和常规检测手段。将感染病毒的植物组织制成电子显微镜检查样本通过电磁波源，利用电磁波的电子流，在电子显微镜下显示病毒的形态、大小、内含体以及染病组织超微结构等，从而诊断出病毒的种类。1959年电镜负染技术首次应用于病毒结构的研究，Brenner和Horne通过一些重金属离子能在蛋白体四周沉淀，在电镜下形成一个黑暗的背景，而蛋白体内部没有金属离子的沉积而形成一个清晰的亮区，使成型的图像呈底片样貌，因此称为负染色技术[5]。通过不断的发展和完善，电子显微镜检测技术被广泛应用并与其他技术相结合产生了新的方法，免疫电镜技术就是其中的一种，目前免疫电镜技术已应用于病害诊断、病原鉴定、机理研究等多项领域[6]。
　　电子显微镜检测技术是一种能够快速、灵敏而简便地检测出植物RNA病毒的方法，能够通过观察到病毒的结构、大小、形态、有无包膜等确定其种类。然而使用电子显微镜检测，专业要求较高，对典型病毒的特点和不同病毒组的形态必须有所了解，而且检测过程中易受到寄主内含物的影响而干扰结果。观测样本制作要求较高，操作技术复杂，对仪器设备有较高要求。
　　3 血清学检测法
　　血清学检测方法是利用抗原与抗体结合而产生的免疫学反应来进行植物RNA病毒的检测，是一种常用的植物RNA病毒检测方法。目前，国际上已制备有200余种植物病毒的免疫试剂[7]。我国已制备出30余种植物病毒的检测试剂，用于植物病毒监测与检疫的研究。
　　3.1 酶联免疫吸附法
　　酶联免疫吸附法（ELISA），是一种将抗体抗原的免疫反应与酶的催化反应相结合，快速的检测植物RNA病毒的方法。原理是将酶与抗原或抗体结合形成酶标物，通过化学反应使酶标物与相应的抗体或抗原产生反应，形成复体呈出颜色反应，检测出目的病毒。抗原或抗体吸附于酶联板，用酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合形成酶标复合体，复合体上的酶遇对应的反应底物时，使底物水解生成不溶的或可溶的有色物质。如果生成的是可溶的有色产物可用肉眼或比色计进行观测，如果生成的是不溶的有色物质，可通过电子显微镜进行识别和定量分析。自Clark等[8]研究并报道出酶联免疫吸附检测病毒的理论方法以来，ELISA广泛应用在植物病毒的检测中。在酶联免疫吸附原理的基础上通过不断地改进，形成许多与ELISA有关的检测方法。根据酶标物是抗体或抗抗体及检测时添加抗体、抗原的顺序等，将ELISA分为直接ELISA（Direct ELISA）、间接ELISA（Indirect ELISA）、单克隆捕获ELISA（Mac-ELISA）、三抗夹心ELISA（TAS-ELISA）、双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）、A蛋白双抗夹心ELISA法（PAS-ELISA）等。在植物RNA病毒的检测中应用最多的是双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）。 　　3.2 点免疫结合测定法
　　即点免疫结合测定技术（Dot Immunobinding Assay，DIBA）是在酶联免疫吸附法的基础上通过研究发展来的一种植物RNA病毒检测技术，由Hawkes等[9]于1982年研究成功并建立。基本原理是通过酶标记抗体与吸附于硝酸纤维膜（简称NC膜）上的抗原发生特异性结合产生免疫复合体，加入相应的酶反应物后产生不溶的物质，在硝酸纤维膜上形成有色的斑点。而根据膜上有无斑点和斑点的颜色可以判断免疫反应是否产生以及抗原多少。该技术的优点是通过硝酸纤维素膜取代酶联板，从而保持了ELISA对病毒检测的高灵敏度和强特异性，并且简化了操作程序，使病毒的酶联免疫吸附检测更加简单、快速、方便[10]。
　　3.3 胶体金标记检测
　　胶体金标记检测是通过用柠檬酸钠将氯金酸离子还原为胶体状金，胶体金颗粒在一定的条件下吸附抗体IgG（或A蛋白）分子，形成稳定的IgG（或A蛋白）-胶体金复合物。用胶体金颗粒检测植物组织榨取物只需10 min，而灵敏度与ELISA相当。Pares和Whitecross于1982年首次研究胶体金标记的抗体检测植物病毒技术，目前该技术已被不断研究和改进。傅仓生等[11]研究制备出适于植物病毒的胶体金颗粒，并以此胶体金与A蛋白结合形成复合探针，检测烟草花叶病毒。利用胶体金免疫电镜技术胡东维等对郁金香杂色综合症病原进行了鉴定和检测[12]。陈建平等[13]将胶体金免疫电镜技术应用于感病植物汁液病毒的检测，从而提高了抗体对病毒的捕获能力。
　　4 分子生物学方法
　　相较于血清学方法，从分子水平来检测病毒，具有更高的灵敏度，可以检测到皮克（pg）甚至飞克（fg）级以下的植物病毒[14]，并且检测的植物RNA病毒更加广泛，特异性更强，对类病毒也可进行检测，同时能够进行批量样本的检测。近年来，分子生物学方法被广泛地应用于各种植物病毒的检测，成为检测植物病毒的重要方法。
　　4.1 核酸杂交检测法
　　根据核苷酸单链互补可以相互结合的原理，通过将病毒核酸单链制成探针以某种方式加上标记，检测待测样品中互补的核酸，通过带有探针的杂交核酸来指示病原的技术，即为核酸杂交检测技术。Kirkpatrick B C等[15]1987年首次通过叶蝉作为原始材料分离和克隆了西方X病病原体DNA，并创立了点杂交（Dot Blot）分析法用于病原体的检测。而后国内的研究者将该项技术用于多种植物病毒的检测，如刘凌凤等[16]、孟 清等[17]、吕典秋等[18]。
　　4.2 PCR技术
　　聚合酶链式反应（PCR）是Kary Mullis等人于1983年在美国首先创建的一项体外扩增DNA的技术，利用模板DNA、脱氧核苷酸和引物在一定的条件下，通过DNA聚合酶的催化，体外合成扩增出特异的DNA片段。
　　4.2.1 反转录PCR（RT-PCR）。大多数植物RNA病毒需要以RNA为模板，在反转录酶的作用下逆转录合成cDNA再以cDNA链为模板进行PCR反应，这就是两步法RT-PCR技术。魏梅生等[19]根据烟草线条病毒的外壳蛋白基因，设计了一对特异性引物，提取大豆病叶中的总RNA，反转录成cDNA后扩增PCR产物，通过载体克隆转化到大肠杆菌中，获得430 bp大小的目标片段，经序列测定，确认为烟草线条病毒的外壳蛋白基因的RNA片段。张俊祺等[20]根据烟草黄瓜花叶病毒各株系全基因组序列设计一对引物通过优化反应的条件，建立了一步法RT-PCR检测烟草感染CMV病毒的方法，设计建立了特异性强、重复性好、灵敏度高的检测试剂盒。沈建国等[21]采用一步RT-PCR建立了快速检测水仙黄条病毒的方法。
　　4.2.2 多重RT-PCR（Multiplex RT-PCR）。多种植物RNA病毒的复合侵染，可以通过多重RT-PCR方法同时检测多种病毒，在短时间内检测大量样本，提高检测效率，降低检测成本，而且检测成本低，是其他检测方法所不能比拟的。周国辉等[22]建立了CyMV和ORSV的多重RT-PCR检测技术。PCR检测技术灵敏、快速、特异性强，对比免疫学方法专一性和灵敏性都有所超越，是常用的常规植物RNA病毒检测方法。仅用少量植物感病叶片提取总RNA，运用PCR技术就可灵敏地检测到是否存在感染。现在操作快速、简单、重复性好的PCR技术整个检测完成的时间相较于ELISA法检测所用时间大大缩短，而且减少了必须制备抗血清的限制。
　　4.3 基因芯片技术
　　基因芯片技术是一项高新技术最近迎来了迅猛的发展，是植物RNA病毒快速检测技术的一个重要发展方向。该技术可同时并实时地检测感染植物中的多种不同病毒，甚至通过探针可以区分不同的病毒亚株系，对于确定植株中由何种病毒感染非常适合，与其他的分子检测技术相比，更加高效、准确、快捷[23]。贾 慧等[24]利用CMV、TMV和PVY的外壳蛋白基因保守序列，设计出2条探针，建立了从病毒侵染样本中检测到特异性识别信号并同时检测多种病毒的基因芯片检测方法，而这一方法的检测灵敏度相较于多重PT-PCR方法更高，能更加快速而准确地检测出植物RNA病毒。
　　4.4 双链RNA技术
　　双链RNA的提取在研究大多数为RNA病毒的植物病毒中是一个重要的手段[25]。Morris和Dodds首次将双链RNA（dsRNA）技术应用于植物和真菌病毒的检测研究中[26]。植物体中存在的核酸包括DNA和RNA，而DNA转录产生RNA存在时间短、片段长，dsRNA在理论上不存在于正常的植物体内，Morris和Dodds的研究结果表明，某些正常植物体内会存在一些低分子量的dsRNA（<1×106），但大分子量的dsRNA（>1.0×108）的出现与含植物RNA病毒的基因组有关，因而可以利用dsRNA检测病毒病原物。大多数植物病毒基因组为单链ssRNA，病毒侵染寄主后通过寄主体内物质进行复制时，首先会产生一条与基因组RNA互补的链，配对形成双链模板，即dsRNA前体。再通过互补链转录出子代基因组RNA，互补链与基因组RNA长度相同，可在寄主体内大量积累。某些植物病毒本身基因组为dsRNA，因而复制后会产生大量子代dsRNA基因组，而通过dsRNA的检测就能准确地反应出寄主的感染。 　　dsRNA对DNase和RNase具有耐受性，因而在提取过程中可以使用DNase和RNase除去多余混杂的DNA和RNA。李 贺等[27]研究了草莓植株中病毒dsRNA对RNase和DNase酶的耐受能力。dsRNA对双酶具有较高的耐受性，因而可以使用此方法得到较纯的dsRNA，用于后续的检测和研究。目前，dsRNA主要用于病毒病及病源鉴定、病毒分化株系的鉴定，以dsRNA为中介对病毒核酸序列进行研究、探针的制备和cDNA克隆的获得和用于检测病毒卫星RNA和亚基因组RNA，有待开发和利用。
　　5 结语
　　以上所叙述的植物病毒检测方法，为现代检测植物病毒的一些常规方法，目前我国对植物病毒病的研究和检测仍然停留在实验和研究之中，还没有形成易于推广、灵敏度更高、特异性更强、准确率更高的检测技术和方法。相信随着经济的发展、科技的进步，分子生物学的发展，病毒检测技术终将出现便于操作，具有高重复性，灵敏的植物病毒学检测方法，并研制出用于植物病毒检测多功能试剂盒。
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