玉米转基因方法研究进展

来源:用户上传      作者: 王景超

　　摘要 玉米转基因方法有多种，最主要的是基因枪转化法和农杆菌介导转化法。本文综述了玉米转基因方法的研究进展，对影响转化频率的因素进行了总结，并分析了标记基因的使用现状。
　　关键词 玉米；转基因；基因枪；农杆菌介导
　　中图分类号 S513 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）06-0034-02
　　Study Progress on Maize Transformation Methods
　　WANG Jing-chao
　　（Shandong Product Quality Inspection Research Institute，Ji′nan Shandong 250100）
　　Abstract There are many methods for maize transformation，and the particle bombardment and agrobacterium-mediated transformation are the most commonly used. This paper reviewd the research progress of maize transformation，and the critical factors that influence the transformation frequency.It also analyzed the selected markers.
　　Key words maize；transformation；particle bombardment；agrobacterium-mediated
　　从20世纪80年代中期开始，在玉米的遗传转化方面做出了多种尝试，主要有电击法、碳化硅晶体转化法、基因枪法和农杆菌介导法。其中基因枪法和农杆菌介导法得到了积极发展[1-2]。80年代末通过基因枪法首次获得了可育的转基因玉米[3]，而在1996年，报道了一种有效的农杆菌介导的玉米转化方法[4]。因为农杆菌介导法得到的转基因植株具有单拷贝或低拷贝的优点，因此在玉米研究中开始倾向于使用这种转化方法。本文对玉米遗传转化方法做一综述，并对其应用前景做一展望。
　　1 常用的玉米转基因方法
　　1.1 电击法
　　细胞壁被认为是DNA穿过细胞的最大障碍，于是原生质体被选作最初的转化材料。通过电击法转化玉米的原生质体，获得了稳定的转化系[5]，但是得不到可育的转基因植株。目前研究发现，电击法转化原生质体可当作瞬时转化工具来分析基因功能[6]。
　　1.2 碳化硅晶体转化法
　　碳化硅晶体（SiC）是工业上生产复合材料使用的一种针状晶体[7]，利用携带外源遗传信息的碳化硅晶体轰击玉米外植体，是一种最简单的将DNA导入玉米细胞的方法。该方法因操作简单、成本低廉而深受喜爱，但是它只能应用于很少数目的组织如分散很好的玉米悬浮培养系[8]或愈伤组织[9]中，影响了该方法的推广。
　　1.3 基因枪法
　　所谓基因枪转化，是指将DNA包裹到重金属微粒上，通过外力直接将DNA导入植物细胞或组织中。因为高速运动的微粒可以很轻松地穿过细胞壁，成功避开了去除细胞壁的要求，所以各种类型的组织都可作为受体。利用这种方法得到的最早的转基因植株来自细胞悬浮培养物和Ⅱ型愈伤受体[3，10-12]。之后，利用Ⅰ型愈伤、幼胚、茎端分生组织等外植体作为受体，也成功获得了转基因植株[13-16]。在此方法报道后不足6年的时间，利用该方法获得的抗虫转基因品种就已商业化。利用这种方法获得了多种不同的玉米基因型的转基因植株。
　　1.4 农杆菌介导法
　　土壤中的根癌农杆菌能利用肿瘤诱导相关质粒（Ti质粒）将DNA片段（T-DNA）转到植物细胞中[17]。科学家们利用这种机制研究出了多种双子叶植物的高效转化方法。由于单子叶植物没有根癌农杆菌的天然宿主，因此推测这种方法不能推广到单子叶植物上[18]。尽管如此，科学家们还是在玉米和其他谷类作物上进行了尝试。后来，利用改造的生物载体成功获得了转基因玉米。该方法具有整合位点稳定、外源插入片段大、外源基因拷贝数少等优点，因此得到了广泛应用。但是它只适用于极少数的基因型，而且是在农艺性状差的A188自交系和它的变种中有较高的效率。为此，之后又进行了大量的尝试来扩展可适用的基因型和提高转化效率[19-22]。
　　2 影响转化频率的因素
　　经过多年的研究，通过转基因技术获得可育的玉米转基因植株已不再是难题。但是要想获得高效的转化频率，还要通过不断优化转化体系来实现。下面就通过常用的2种转化方法来总结影响转化频率的因素。
　　影响基因枪法转化成功与否的关键因素可被分为2类：生物参数和物理参数。最主要的生物参数是高渗处理和轰击前的幼胚预培养[12，23]。为了提高转化频率，通常会用添加有甘露醇、山梨醇等的高渗培养基在轰击前后培养受体材料[12]。物理参数主要包括金属微粒的体积、微粒的类型、收集微粒的方法、微粒的离心速率、微粒表面黏附的DNA的量等[24-25]。
　　农杆菌介导的转化系统涉及植物细胞和细菌这2种生物体系。要优化这个系统，就需要最大限度地降低细菌对植物细胞的伤害，最大限度地恢复转化子的活性。为此，可以在侵染阶段和共培养阶段进行一系列条件优化。例如，将侵染幼胚的菌液浓度控制在OD值为0.6～0.8[4，20]，将幼胚置于细菌悬浮液中[26]，在侵染液中添加表面活性剂[27]等；在共培养培养基中添加乙酰丁香酮[4]、硝酸银[20]、硫酸铜[28]和L-半胱氨酸[19]，并将共培养培养基的pH值调至5.8[4]，以及将共培养温度控制在20～25 ℃之间[19]等，这些条件都能在他们各自的研究中有效地提高转化频率。此外，在侵染之前对幼胚进行热击和离心处理，也能提高转化效率[29]。在玉米中，最适的条件是46 ℃热击3 min，接着20 000×g离心10 min[28]。 　　3 标记基因的选择
　　标记基因是用来筛选和鉴定转化细胞、组织和转基因植物的有效途径。最开始使用的标记基因主要有新霉素磷酸转移酶基因nptⅡ、潮霉素磷酸转移酶基因hpt，之后又选用了草丁膦乙酸转移酶基因bar和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因epsps等[30]。这些都属于负向选择系统。影响这类基因广泛应用的主要问题是当转基因植物再生成功以后，标记基因便毫无用处，而这些基因已经整合到植物基因组中，会产生一些有毒产物，影响转基因玉米的推广；并且存在基因漂移的可能性，对生态环境存在潜在威胁。这些都是转基因技术亟需解决的问题。出于标记基因安全性和筛选剂性价比的考虑，属于正向选择系统的甘露糖异构酶基因pmi是比较合适的筛选标记基因。类似基因的安全性使它能应用于经济作物的遗传转化，因此这类基因有望成为以后植物筛选研究的主导系统[31-32]。
　　4 展望
　　2009年玉米全基因组测序完成，为研究玉米基因的功能创造了条件，也为在分子水平上对玉米进行遗传操作的玉米分子育种提供了直接、准确、可靠的依据，为玉米转基因技术的发展带来了一个新的契机。我国地域广阔，人口众多，面临着人均耕地面积偏少的现状，加之我国土地资源具有农用土地资源比重小和后备耕地资源不足等特点，这就要求提高单产[19]。通过转基因技术可以突破种间隔离、加速育种进程，为育种学者选育高产优质的新品种提供了新机遇。
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