湖北不同地区甘薯蔓割病病原菌的分离与分子鉴定
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作者: 雷剑 王连军 杨新笋 苏文瑾 柴沙沙
摘要：2011～2014年分别从湖北省甘薯主产区十堰市、武汉市、宜昌市等地分别采集了甘薯蔓割病（Fusarium bulbigenum）发病典型植株，在实验室分离纯化并培养，并对分离得到的真菌核糖体基因转录间隔区进行测序分析。测序结果显示目的片段长度为544 bp，武汉和宜昌的序列完全一致。从十堰扩增出来的序列的385位置是C而武汉和宜昌扩增的结果该位置是T，说明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯镰孢菌存在多态性。
关键词：甘薯；甘薯蔓割病（Fusarium bulbigenum）； 病原菌； 分离； 分子鉴定
中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6235-02
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.034
Abstract： From the city of Shiyan， Wuhan， Yichang， 3 Fusarium bulbigenum pathogens were separated and purified. by Molecular identified F. bulbigenum from different regions of Hubei province. The test results showed that the length of the target fragment was 544 bp， and the sequence of Wuhan and Yichang was the same. From Shiyan amplified sequence of 385 position was C and Wuhan and Yichang amplification results of the location was T， molecular indicating that the F. bulbigenum from different regions of Hubei province presenced polymorphism.
Key words： sweetpotato； Fusarium bulbigenum； pathogenicity； isolation； molecular identification
甘薯具有高产、稳产、适应性广、抗逆性强、营养丰富、用途广泛等特点，是中国仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物[1，2]。甘薯蔓割病又称镰刀菌枯萎病（Fusarium bulbigenum），是中国南方甘薯产区的一种主要真菌性病害，近年来有向长江中下游区域蔓延的趋势，根据2011年以来湖北省甘薯主产区主要甘薯病害调查结果显示，十堰市、武汉市、荆州市及宜昌市均发现了甘薯蔓割病的危害，部分田块发病率高达30%以上。该病在田间随机分布，一般减产10%～20%，重者达50%以上，对甘薯高产、稳产威胁极大[3]。为此，本研究通过采集湖北省甘薯主产区十堰市、武汉市及宜昌市的蔓割病病样，分离培养各地区采集的蔓割病病原菌样本，鉴定各地区蔓割病病原菌的致病力差异，分析其表型及分子水平上的差异，为指导各地区蔓割病的防治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
蔓割病病原菌为2011～2014年间在湖北省甘薯主产区十堰市、武汉市、宜昌市等地分离纯化得到的蔓割病病原菌菌株，依次命名为SY菌株、WH菌株及YC菌株。
1.2 方法
1.2.1 病原菌分离 将发病植株清洗干净，取病健交界处茎段0.5 cm，剥去外皮，清洗。在超净工作台上用消毒的解剖刀切成0.2 cm×0.3 cm的小块，放入75%的乙醇中消毒3 min，移至5%次氯酸钠溶液中浸泡3 min，取出用无菌水冲洗3次，用灭菌的滤纸吸干水分，接种在PDA培养基上，28 ℃培养2 d左右，观察有无丝状物出现[4-7]。
1.2.2 病原菌纯化培养 在超净工作台上用灭菌的挑菌针挑取菌丝转移到空的PDA培养基上。28 ℃培养2 d左右，观察有无杂菌，如有杂菌继续重复上述工作，直到PDA培养基中只有单一的蔓割病病原菌菌丝为止。
1.2.3 病原菌形态学观察 在载玻片上滴一滴乳酸棉兰染色剂，用接种针挑一点菌丝，分散在染色液当中，盖上盖玻片，排气泡，2 min左右放到光学显微镜下100倍观察，比较不同区域采集分离的病原菌在形态学上是否存在差异。
1.2.4 分子鉴定 对分离得到的甘薯镰孢菌核糖体基因转录间隔区进行测序分析，研究湖北省甘薯镰孢菌的多态性。利用PDA培养基对待检菌体进行培养（28 ℃，48～72 h），收获菌丝体以备核酸提取、真菌DNA基因组提取、核酸纯度和浓度检测、rDNA-ITS 扩增，rDNA-ITS测序与分析。
2 结果与分析
通过分离纯化获得了十堰市、武汉市、宜昌市3个地区的甘薯蔓割病病原菌分离物，并对3个地区的蔓割病病原菌进行了显微镜检，结果显示为镰刀菌属，且各地区的病原菌在形态上差异并不明显（图1）。
对3个地区分离得到的真菌核糖体基因转录间隔区进行测序分析。测序结果如下：TCCGTAGG
T GAACCT GCG GAGGGAT CAT TACCGAGT T TACAA
C T CCCA AACCCC T GT GAACATACCACT T GT TGCCT
C GCGGA TCAGCCCGC T CCCGGT AAAACGGGACG G
CCCGCCAGAGGACCCC T AAACTCTG T T T CTATAT G
TAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAA C T T T CAACAACGGA T C TCT T GG T TCTGGCATCGAT
G AAGAA CGC AGC AAA ATGC GAT AAG TAA TGT GA
ATTGCAGAAT TCAGT GAAT C ATCGAATCT T TGAAC
GC AC AT TGCG CCC GCC AG TA T T CTG GCGG GCAT G
CCTGTTCGAGCGTCA T T TCA ACCC TCAAGCACA GC
TTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAA
ATTGATTGGCGGTCACGTCGAGC T T CCAT AGC GTA
G TA GT AAAACCC T CG T TAC TGG TAA TCG TC GCGG
CCACG CCG T TAAAC CCCA ACTTCTGAATGT TGACC
TCGGAT CAGG TAG GAAT AC CCGC T GAAC T T AAGC
ATATCAATAAGCGGAGGA。
目的片段长度为544 bp，武汉市和宜昌市的序列完全一致。从十堰市扩增出来的序列的385位置是C，而武汉市和宜昌市扩增的结果该位置是T，说明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯镰孢菌存在多态性。
3 小结与讨论
试验结果表明，十堰市、武汉市、宜昌市3个地区的甘薯蔓割病病原菌100倍显微结果显示为镰刀菌属，且各地区的病原菌在形态上并无明显差异。通过对3个地区分离得到的真菌核糖体基因转录间隔区进行测序分析表明，目的片段长度为544 bp，武汉市和宜昌市的病原菌真菌核糖体基因转录间隔区序列完全一致。但是从十堰市扩增出来的序列的385位置是C，而武汉市和宜昌市扩增的序列该位置是T，说明引起湖北省甘薯蔓割病的甘薯镰孢菌在分子水平上存在多态性。这个多态性也许会导致不同区域分离的病原菌具有不同的致病力。后续将开展人工接种抗病鉴定试验，确定3个地区分离病原菌致病力的差异，以验证分子水平上的差异是否会带来致病性上的差异。
参考文献：
[1] 福建莆田地区农科所，平潭县农技站.甘薯蔓割病的发生规律与防治[J].福建农业科技，1978（2）：27-32.
[2] 方树民，陈玉森.福建省甘薯蔓割病现状与研究进展[J].植物保护，2004，30（5）：19-22.
[3] 小川奎，褚茗莉.甘薯蔓割病的防治[J].杂粮作物，1984（1）：56.
[4] 方树民，陈玉森，郑光武.甘薯主栽品种对甘薯瘟和蔓割病抗性评价[J].植物保护，2002，28（6）：23-25.
[5] 柯玉琴，潘廷国，伍迪明，等.甘薯抗蔓割病的生理机制I.感染蔓割病后甘薯叶片脂质过氧化及保护酶的变化[J].福建农业大学学报，1994，23（1）：112-116.
[6] 柯玉琴，潘廷国.甘薯抗蔓割病的生理机制II.甘薯抗蔓割病与多酚氧化酶及其同功酶的关系[J].福建农业大学学报，1996， 25（3）：377-380.
[7] COLLINS W W，NIELSEN L W. Fusarium wilt resistance in sweet potatoes[J].Phytopathology，1976，66（4）：489-493.
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