猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

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　　摘要:从天津市郊县某猪场发病仔猪脑中分离到一株病毒。该病毒接种鸡胚绒毛尿囊膜有白色的痘斑出现,接种PK-15和BHK-21细胞出现典型的细胞病变,毒价(TCID50)为10-6/mL,且能被PRV阳性血清中和;将病毒给家兔注射后出现典型的伪狂犬病症状并导致死亡。通过上述试验结果证明,该分离毒株为伪狂犬病毒。
　　关键词:猪;伪狂犬病毒;分离;鉴定
　　中图分类号:S858.28文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.03.002
　　
　　Isolation and Identification of Swine Pseudorabies Virus
　　HAN Wei,DING Bo-liang,WANG Ying-zhen,ZHANG Li
　　(Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science,Tianjin 300112,China)
　　Abstract:One virus was isolated from brain organ of diseased pig which came from a pig farm in Tianjin. After inoculating the virus,the white spots could be seen in chick embryo chorioallantoic membrane, and typical cytopathogenic effect(CPE)appeared in PK-15 and BHK-21 cells. TCID50 of the virus was 10-6/mL.The virus could be neutralized by standard positive serum of pseudorabies virus. After injecting the virus, rabbits showed typical pseudorabies clinical symptom and died. By the above experiment results, the isolated virus was identified as PRV.
　　Key words: pig;pseudorabies virus;isolation;identification
　　
　　伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV) 引起的一种高度接触性、急性传染病。该病毒可引起多种家畜和野生动物发病,猪是该病原的传播者和自然宿主。临床表现为新生仔猪发热、腹泻和神经症状;母猪流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍症[1,2]。本病流行已给养猪生产造成了巨大的经济损失,严重影响了养猪业的发展。近年来,天津地区猪场也时有该病的发生,笔者从天津某发病猪群分离到一株病毒,经试验鉴定为猪伪狂犬病病毒。
　　
　　1材料和方法
　　
　　1.1材 料
　　病料:脑组织采自天津郊县某猪场发病仔猪。
　　细胞与培养基:PK-15、BHK-21细胞由本实验室保存并提供;MEM培养基购自GIBCO公司;新生牛血清购自北京民海生物公司。
　　鸡胚及试验动物:种蛋购自天津市某种鸡场,在本室孵化至10日龄后使用,试验用兔购自天津西青某养殖场。
　　PRV标准毒株及阳性血清:PRV闽A株由本实验室保存,PRV阳性血清由本实验室制备。
　　PCR引物:按文献[3]的引物设计合成,预期产物178 bp。
　　PRV( gE)U3:4655'ATGGGCATCGCCGACTACCT3'
　　PRV( gE)L3:6425'CCACCGCCACAAAGAACACG 3'
　　1.2方 法
　　1.2.1病毒分离[4,5]取病仔猪脑加入5倍量Hanks液(pH7.0,内含青、链霉素各1 000 U/mL),研磨成匀桨,4 ℃过夜处理后4 000 r/min离心30 min,取上清液接种PK-15和BHK-21细胞,37 ℃作用1 h,期间每隔20 min摇晃一次,作用完毕弃去接种物,加入含有2%新生牛血清的MEM维持液,并设空白对照和阳性对照(PRV闽A株)。每日观察2次,观察5 d,当接种细胞出现细胞病变(CPE),并达到80%以上病变时收获传代,分离病毒株并连续传至F7代,以适应细胞生长。
　　1.2.2毒价测定[6]取分离病毒株的F7代毒株作10倍系列稀释(10-1～10-10),接种于已长成单层的PK-15细胞96孔细胞板,每个稀释度接种8孔,每孔接种0.1 mL,第11、12 列为2%新生牛血清的MEM维持液做空白对照。连续观察7 d,记录各个梯度的病变数,按Reed-Muench 法计算分离毒株的病毒半数细胞感染量(TCID50)。
　　1.2.3中和试验[6]用固定病毒稀释血清法。将PRV阳性血清分别进行2倍、3倍、5倍稀释,再加入等量体积并稀释至200个TCID50分离毒株,37 ℃作用1 h,每个稀释度做4次重复,分别接种于已长成单层的PK-15细胞板,设维持液空白对照和PRV闽A株阳性对照,连续观察5 d,记录各个稀释度的细胞病变数。
　　1.2.4鸡胚绒毛尿囊膜接种[6]将上述的分离毒株培养物接种于3枚10日龄鸡胚绒毛尿囊膜,每枚接种0.2 mL,并同时设同剂量的2%新生牛血清的MEM维持液接种鸡胚作为对照,37 ℃孵化144 h,每日照蛋2次。弃去24 h死亡的鸡胚,观察24 ~144 h死亡和未死亡的鸡胚绒毛尿囊膜是否有痘斑形成。
　　1.2.5PCR鉴定按文献[3] 应用特异性引物进行PCR扩增,最后进行琼脂糖凝胶电泳,观察PCR扩增结果。
　　1.2.6动物实验[7]取分离病毒株的F7代毒株接种3只家兔颈部皮下,每只注射1 mL,空白对照家兔接种同剂量的MEM维持液,两个试验组分开饲养14 d,每天观察家兔的采食、体温、精神状态等情况。
　　
　　2结果与分析
　　
　　2.1病毒分离
　　病料接种PK-15细胞后,F2代观察到CPE。接种细胞后48 h镜检,可见细胞拉长、变圆,为特征性病变,至72 h可见细胞脱落,参见图1,2。其分离毒株在BHK-21细胞传代,病变为细胞拉长、变圆、形成巨细胞,参见图3,4。其细胞病变同PRV闽A株的病变一致。
　　2.2病毒毒价测定
　　分离毒株的TCID50为10-6/mL。
　　
　　2.3中和试验
　　PRV阳性血清与分离毒株中和的结果见表1。表1表明,阳性血清稀释2倍、3倍时没有出现细胞病变,阳性血清5倍稀释时出现细胞病变。PRV闽A阳性对照株均未出现细胞病变,结果表明,已知PRV阳性血清能中和分离毒株与PRV闽A株在细胞上的病变,但存在一些差异。
　　
　　2.4鸡胚绒毛尿囊膜接种
　　分离株接种后144 h,鸡胚均未死亡,4 ℃冻胚4 h后观察病变,可见鸡胚绒毛尿囊膜水肿、增厚并有白色的痘斑,对照鸡胚绒毛尿囊膜无异常病变(图5)。
　　
　　2.5PCR鉴定
　　分离毒扩增出预期的PCR产物,PCR检测阳性(图6)。
　　
　　2.6动物试验结果
　　接种分离的病毒悬液的家兔,注射后3 d表现为奇痒,用嘴啃咬注射部位,使注射部位被毛脱落,皮肤受损,继而死亡。而注射MEM维持液的对照家兔无异常变化。
　　
　　3讨 论
　　
　　(1)本试验通过细胞培养分离病毒、鸡胚绒毛尿囊膜接种、动物接种试验、中和试验和PCR鉴定,证明该病毒为猪伪狂犬病毒,将新分离的病毒命名为TJ-1株。
　　(2)PRV为疱疹病毒属病毒,能够在鸡胚绒毛尿囊膜上形成明显的痘斑,家兔攻毒后出现典型的瘙痒症状,这两种方法操作简便,结果容易分辨,对于没有细胞培养条件的实验室可以作为一种有效的初步鉴定方法。
　　(3)伪狂犬病只有在仔猪出现神经症状,而母猪繁殖障碍的临床表现又与猪瘟、细小病毒、乙脑和猪呼吸与繁殖障碍综合征症状类似时发生,鉴别诊断比较困难,通过实验室的病原分离可以做出正确的诊断。在国内应推行PRV基因缺失疫苗免疫预防,再进行相应的鉴别诊断淘汰阳性猪,净化猪群,进而根除伪狂犬病,提高我国养猪业的水平。
　　
　　参考文献:
　　[1] 蔡宝祥.家畜传染病学(第4版)[M].北京:中国农业出版社,2001:207-209.
　　[2] 斯特劳,阿莱尔,蒙加林,等. 猪病学(第8版)[M].赵德明,张中秋,沈建中,译.北京:中国农业大学出版社,2000:238-253.
　　[3] 张莉,丁伯良,王英珍,等.区分猪伪狂犬病毒gE缺失疫苗株和野毒株的gE-PCR方法的建立[J].动物医学进展,2008,29(11):5-8.
　　[4] 陈焕春,方六荣,何启盖,等.猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定[J].畜牧兽医学报,1998,29(2):97-104.
　　[5] 黄伟坚,温荣辉,秦爱珍,等. 猪伪狂犬病病毒桂W株的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,2000,22(4):241-243.
　　[6] 殷震,刘景华. 动物病毒学(第2版)[M].北京:科学出版社,1997:329-340,998-1009.
　　[7] 杨润德,郁宏伟,张洪德,等.猪伪狂犬病病毒的分离鉴定[J].中国兽医杂志,2008,44(1):25-26.

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