生物多糖研究进展

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　　摘要：对生物多糖的提取、分离纯化以及降血糖、抗氧化、抗肿瘤等重要功能活性的研究进展进行了综述，并对其应用前景进行了展望。
　　关键词：生物多糖；提取；分离纯化；生物活性
　　中图分类号：Q539　文献标识号：A　文章编号：1001－4942(2011)05－0098－04
　　
　　多糖(Polysaccharide)是指一类由10个以上单糖分子聚合而成的天然高分子化合物，是维持生命活动正常运转的基本物质之一，广泛存在于动物、植物、微生物(细菌和真菌)和藻类地衣中。其中研究较早且最多的是从细菌中得到的各种荚膜多糖，它在医药上主要用于疫苗。1984年，苏联人在荷兰召开的第十二次国际碳水化合物讨论会上报道了荚膜多糖用作疫苗，引起与会者的极大兴趣。动物多糖包括肝素、透明质酸、壳多糖等。肝素以其抗凝血、改善微循环的作用，已应用于各种心脑血管疾病，透明质酸和壳多糖由于它们良好的生物相容性和几乎无毒副反应，已被广泛地应用在药物辅料方面。真菌多糖的研究既深又广，如香菇多糖、白桦茸多糖、云芝多糖、灵芝多糖等。一些多糖药物已经在临床上作为治疗癌症的辅助药物使用，如香菇多糖和云芝多糖等。另外，在对各种中药材化学成分研究的过程中，人们逐步提高了对植物多糖的关注。植物多糖研究比较深入的是茶多糖、胖大海多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、银杏叶多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品领域已经取得很好的应用。多糖作为重要的生物活性物质具有调节免疫、抗肿瘤、降低糖脂、延缓衰老等活性，在医疗保健、食品、动物养殖等领域有着广阔的应用前景。
　　
　　1多糖的提取及纯化
　　
　　1.1多糖的提取
　　多糖的提取通常要根据多糖的存在形式及提取部位不同决定其提取方法。一般含脂高的原料，在提取之前先采用丙酮、乙醚、乙醇等进行预处理，目的是脱脂。
　　
　　1.1.1溶剂法提取原料不同，多糖的提取方法也不相同，不同提取法各有利弊。采用碱溶液提多糖时，易使多糖的糖苷键断裂，通常要充氮气或加入硼氢化钠或硼氢化钾加以保护，且这种提取方法只适用于含果胶物质少、粘度小的原料；酸性条件下提取，也会引起多糖降解及糖苷键的断裂，因此在稀酸提取时，时间宜短、温度不宜太高；水提法提取成本低，适用于游离态多糖的提取，且干扰物质少、易除去，但时间长且效率低。
　　
　　1.1.2微波和超声波辅助提取微波辅助提取技术主要是利用微波加热的特殊性质，细胞内的极性分子吸收微波能后产生撕裂和相互摩擦引起发热，使胞内温度迅速升高，连续高温使其内部压力急剧升高，导致细胞破裂，促进溶剂进入和胞内成分流出，提高提取效率。Wang等(2010)利用微波辅助法提取鹅绒委陵菜中的多糖，在微波功率523 w条件下，提取率达到13.33%，与传统水提法相比不但极大缩短时间、节约能源、提高效率，而且提取的多糖具有更高的活性。超声波辅助提取技术是利用超声波产生的振动作用，使媒质质点温度升高，产生空穴效用，加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，提高了破碎速度，缩短了破碎时间，极大地提高提取效率。龚涛等(2005)对枸杞多糖超声波、微波辅助提取和传统水提3种方法进行了对比试验，结果表明，采用传统水提方法，枸杞多糖得率为11.60%；使用微波对样品处理25 min后再进行水提，可使多糖得率提高到15.91%；使用超声波预处理样品40 min后再进行水提，可使多糖得率提高到12.60%。Chen等(2010)利用先进的超声微波协同萃取仪提取白桦茸中的多糖，与热水提取相比，提取率由2.12%提高到3.25%，纯度由64.03%提高到73.16%。
　　
　　1.1.3
　　生物酶辅助提取生物酶辅助的原理在于使用果胶酶、纤维素酶等破坏植物细胞壁，增加有效成分的溶出率来提高提取效率。梁敏等(2010)利用木瓜蛋白酶提取枸杞多糖，在木瓜蛋白酶添加量为O.3%、酶解反应温度为45℃、pH值为7.O、反应时间为2 h条件下，提取率为14.9%，比传统热水提取提高65.6%。李妍等(2010)利用纤维素酶提取巴戟天多糖，在温度55℃、pH5.O、酶用量O.5%、提取时间2 h的条件下，多糖提取率为8.56%，为热水浸提法的l.91倍。
　　
　　1.2多糖的分离纯化
　　多糖提取之后，其中还含有许多杂质要除去。一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤，除去一部分醇溶性杂质，然后用sevag法或三氟三氯乙烷法(微生物多糖)或三氯醋酸法(植物多糖)脱游离蛋白质，小分子杂质的除去可以用透析法。粗多糖中常含有一些色素(游离色素和结合色素)，根据其不同性质采取不同的除素方法。常见的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法(纤维素、藻土、高岭土、活性炭等)。
　　多糖脱色和除蛋白后，还要进一步纯化和分级。采用一般方法提取得到的粗多糖，一般是多糖的混合物，即是多分散性的，化学组成、聚合度、分子形状都有明显的不同。分子量分布很宽，往往从几千到上百万，而具有较强生物活性的部分有可能只是一定分子量范围的多糖，因此分离单一组分的多糖或较窄分子量范围的多糖是很必要的。对多糖分级的方法主要有分级沉淀法、凝胶柱层析法、离子交换柱层析法、超滤分离法等。Kausik等(2007)利用DEAE－sepharose FF纯化绿葡萄藻多糖，Wang等(2010)利用Ultra－hydrogel 500高效凝胶色谱柱分离鹅绒委陵菜中的多糖。姚秋萍刚利用超滤法成功分离了油菜花粉超微粉粗多糖。
　　多糖的纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观也是不均一的，它的纯度只代表相似链长的平均配布。通常所说的多糖纯品实质是一定分子量范围的均一组分。目前，国内外多糖类复合物纯度的鉴定方法主要有：电泳法、纸层析或薄层层析和凝胶色谱法等。
　　
　　2多糖含量的测定
　　
　　一般来说，多糖的定量检测方法可分为两大类。一类是直接测定多糖本身，如高效毛细管电泳法、高效液相色谱法和酶法，前两者需昂贵的仪器和多糖的纯品，后者操作步骤繁琐，且需要特定的酶，故在应用中受到很大限制。另一类是利用组成多糖的单糖的性质进行测定，其中利用单糖缩合反应而建立的方法最多，这些方法简单、快速，无需多糖纯品和高级仪器，因而被广泛采用，如比色法、滴定法。目前使用的比色法有蒽酮一硫酸法和苯酚一硫酸法，其原理为多糖水解生成单糖，单糖可与强酸共热产生糠醛或糠醛衍生物，然后通过显色剂缩合成有色络合物，比色定量，间接求出多糖的含量。
　　
　　3多糖的生理功能研究
　　
　　3.1降血糖
　　多糖降血糖作用可能的机制主要归纳为以下几个方面：①促进葡萄糖转运及外周围组织、靶器 官对糖的利用，降低血中甘油三脂和胆固醇的水平；②保护胰岛B细胞，促进胰岛稳定分泌胰岛素；③影响糖代谢酶的活性，促进糖原合成或抑制肝糖异生；④促进降糖激素和抑制升糖激素作用。
　　很多药物的降血糖作用不是从单一环节，而是从多方面、多靶点综合产生药效的。孙世利等(2010)通过对茶多糖的研究表明，茶多糖通过提高机体抗氧化功能，清除体内自由基，减弱自由基对胰岛β细胞的损伤，并改善受损伤的胰岛β细胞功能，使胰岛素分泌增加，提高胰岛素敏感性，诱导葡萄糖激酶的生成，促进糖分解，使血糖下降。
　　
　　3.2抗氧化
　　当体内活性氧大量产生，其产生速率超过了超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶和抗氧化物质清除限度时，脂质过氧化产物就会大量积累。造成对细胞和机体的伤害。现代自由基医学研究表明，生物体的衰老、癌变、炎症以及免疫性疾病等都与自由基代谢失衡有关。因此，提高机体的抗氧化能力，可以对抗由活性氧及其引发的脂质过氧化产生的疾病。
　　目前已发现多种植物和真菌多糖具有体内外的抗氧化作用，龚涛等(2010)通过研究得出枸杞多糖可通过一系列间接的生理生化机制，促进机体中SOD等抗氧化酶的生物合成或活化，提高了机体的抗氧化能力，减轻细胞的胁迫损伤，保护细胞从而延缓细胞衰老的进程。尚晓娅等(2010)通过对山药多糖的研究得出山药多糖具有一定的还原能力，对羟自由基具有较强的清除能力，并对小鼠肝匀浆自氧化有明显的抑制作用。包怡红等(2010)研究沙棘叶多糖的抗氧化活性得出，沙棘叶多糖具有一定的体外抗氧化能力，其中当多糖浓度为1 200 μg/ml时，对O2的清除率比同浓度的Vc高18.92%。
　　
　　3.3抗肿瘤
　　多糖抗肿瘤机制主要有以下几方面。
　　3.3.1免疫调节作用　多糖是一种免疫调节剂，不但能激活T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞活性，激活网状内皮系统(RES)吞噬、清除老化细胞和异物及病原体的作用，还能促进IL－1、IL－2、INF－λ等生成，调节机体抗体和补体的形成，提高机体抗肿瘤免疫力。研究表明浒苔多糖在SAC刺激诱导产生的细胞因子实验中，对抗原提呈细胞的功能活化有明显作用，能显著地促进细胞活化所介导的IFN－λ的产生。Cao等(2006)研究从Angelica Sinensis中提取多糖的抗氧化活性，实验得出在添加100 mg/kg的纯化多糖时对小鼠肿瘤细胞抑制率达到50.7%，原因是提高了免疫器官的免疫应答活性。
　　
　　3.3.2影响细胞生化代谢　磷脂酰肌醇(PI)存在于细胞膜与内质网，细胞膜上的PI在PI激酶催化下发生磷酸化反应生成磷脂酰肌醇磷酸(PIP)，该过程称为PI转换。有资料表明在肿瘤细胞、恶性转化细胞中PI转换增强，与癌基因激活和肿瘤的发生有关，干扰或抑制PI转换有一定的抗癌作用。唾液酸(SA)与细胞膜的许多功能有关，茯苓、刺五加多糖对肉瘤S180细胞增殖有抑制作用，能增加S180细胞膜sA含量，使膜磷脂、花生四烯酸和豆蔻酸的含量下降，对S180细胞膜H转换有显著抑制作用，其结果与传统化疗药物氨甲蝶呤相似。
　　
　　3.3.3抑制肿瘤细胞周期　细胞周期与肿瘤细胞的生长、增殖、分化等有密切关系。有研究表明某些多糖在体外对肿瘤细胞的生长有抑制作用，其作用机制与细胞周期改变以及某些相关基因的表达有关。
　　
　　3.3.4抗氧化作用　恶性肿瘤患者血液或组织中超氧化自由基的特异性清除酶超氧化物歧化酶(sOD)活性及过氧化氢酶(CAT)的活性明显下降，而脂质过氧化物(LPO)含量增高，DNA被过量的活性氧氧化损伤造成碱基破坏，如果持续损伤或不能有效地修复，则导致细胞癌变。动物实验和临床实验表明石芝多糖能缓解肿瘤宿主体内的氧化应激状态。杨晓萍等(2005，2006)通过对油菜花粉的研究表明，花粉多糖液具有抑制肿瘤和提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的作用。油菜花粉多糖能明显提高机体非特异性的细胞免疫和特异性的体液免疫，提高机体自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。进一步研究得出油菜蜂花粉多糖能明显抑制肿瘤细胞生长，抑瘤率可高达51.26%，并可拮抗化疗药物对机体的损害，同时油菜花粉多糖还能显著提高荷瘤小鼠体内抗氧化酶SOD、CSH－Px的活性，减少脂质过氧化产物MDA含量及降低LDH活性。
　　
　　4展望
　　
　　目前，对多糖的研究越来越全面深入，不断有新型生物多糖被发现，从提取纯化到结构分析乃至合成技术的发展日新月异，为人类更充分地认识、利用多糖提供了有力的技术支持。在多糖生物活性方面的研究也取得了很大的进展，一大批具有良好生物活性的多糖产品上市，在医药、保健品等领域创造了良好的经济效益和社会价值。随着对多糖生物学功能认识的深入，多糖生物学研究已经成为生物化学研究的制高点。以多糖为重点的糖工程研究可能是继蛋白质、基因工程后生物化学和分子生物学领域中的前沿科学，具有很大的潜力和发展空间。
　　
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