SCAR分子标记在甘蓝型油菜S单倍型分类中的应用

来源:用户上传      作者:

　　摘要根据克隆到的ISLGa片段与ISLGb片段核苷酸序列之间的差异,发展了1个SCAR分子标记ISLGb(ISLGb-L+PS15),其引物只在具有ISLGb基因型的3个材料中扩增,并且均得到了大小为1 265bp的单一亮带。通过与已有的相关分子标记整合得到了1套SCAR分子标记体系。包括2个多重PCR分子标记:①ISLG(PS5+PS15)和SP110(SP11-L+SP11-R')用于鉴别ISLG和IISP11b;②ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLGb和IISP11。还包括1个单PCR分子标记:SRKa(S40-5+S60-2)用于鉴别IISRKa。
　　关键词SCAR分子标记;甘蓝型油菜;S单倍型;分类
　　中图分类号 S565.4 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)01-0029-02
　　
　　自交不亲和(Self-incompatibility)是杂种优势利用的重要途径之一,与细胞质雄性不育相比,自交不亲和系杂种具有不受特定胞质的限制、无潜在的不良胞质效应,恢复系广泛、制种产量高等优点。在芸薹属的6个种中,3个基本种,白菜(AA,2n=20)、甘蓝(CC,2n=18)和黑芥(BB,2n=16)表现自交不亲和,而3个复合种包括甘蓝型油菜(AACC,2n=38)、芥菜型油菜(AABB,2n=36)和埃塞俄比亚芥(BBCC,2n=34)表现为自交亲和。虽然对白菜和甘蓝已经做了大量的研究,找到了与自交不亲和性紧密连锁的3个基因,但对甘蓝型油菜的研究很少,对甘蓝型油菜自交不亲和性的分子机理尚不了解。而对甘蓝型油菜的S单倍型进行分类,有助于在一定程度上阐述甘蓝型油菜自交不亲和性的分子机理。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1试验材料
　　研究所用材料为来自国内外的125份普通甘蓝型油菜材料[1],用于建立SCAR(Sequence Characterized Amplified Reg-ions)分子标记体系鉴别自交不亲和S单倍型。其中甘蓝型油菜自交不亲和系S-1300作为母本[2],其他124份甘蓝型油菜作为父本。
　　
　　1.2试验方法
　　1.2.1DNA提取和PCR扩增。选取苗期的油菜鲜嫩叶片0.1~0.2g,用CTAB小量法提取DNA。把DNA浓度调至50 ng/μL左右,以此为模版进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系是:100ng模板DNA,各50ng正向和反向特异引物,1×PCR 缓冲液,1 U Taq 酶,0.15mmoL/L dNTPs 和 2.0mmoL/L Mg2+,加ddH2O至总体积20μL。先用双亲做温度梯度试验,确定适宜的退火温度和时间。将扩增得到的产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。
　　1.2.2PCR扩增产物片段回收、克隆、测序。取30μL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测,在紫外灯管下用刀片切下目标带,然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit试剂盒(上海生物工程技术服务有限公司)回收。将回收的片段进行T-A克隆,然后每个片段选3个阳性单克隆菌样送至南京金思特科技有限公司测序。
　　
　　2结果与分析
　　
　　2.1SCAR分子标记
　　张幸果利用分子标记方法对来自国内外的125份甘蓝型油菜的S单倍型进行了基因型的分类,将甘蓝型油菜分为11种基因型[1]。其中并发展了一个CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)分子标记用于区分ISLGa和ISLGb,但因为CAPS分子标记酶切时间太长,不利于简单、快速检测,因此本试验尝试发展SCAR分子标记。
　　对ISLGa、ISLGb片段测序,其长度分别为1 336、1 345bp,ISLGb与ISLGa的1 336bp相比,具有3个片段的插入,长度分别为6、3、3bp以及1个3bp片段的缺失。在6bp的插入处设计1条引物ISLGb-L(5′TCCTGCCCTTTCGATGTATTT3′),与PS15[3]构成引物对,为特异扩增ISLGb的分子标记ISLGb。并且该标记引物ISLGb-L+ PS15在3个材料(Profit、Maskot、Puma)中均扩增出大小为1 265bp的单一亮带,其退火温度为60℃。另选取基因型为ISLGa的3份材料用此引物扩增,未发现扩增产物(见图1)。
　　
　　2.2多重PCR分子标记
　　多重PCR(multiplex PCR)又称多重引物PCR或复合PCR,是指在同一PCR反应体系中加入2对或2对以上的引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。多重PCR反应相对于1对引物的常规PCR具有高效性、节约性的特点。试验根据已经得到的SCAR分子标记,将它们进行组合,再根据PCR产物的长度和丰度,调整引物的浓度和PCR循环中延伸的时间。经过多次反复试验,2对引物组合成功发展。
　　2.2.1以分子标记ISLG(PS5+PS15)[3]和SP110(SP11-L+SP11-R′)[4]组成的双重PCR对125份材料中分别被ISLGb和SP11a[5]标记的24份材料进行扩增。其PCR反应体系:100ng DNA为模板,10×PCR buffer 3μL,2mmoL/L MgCl2, 0.24mmoL/L dNTPs,1.0U Taq DNA聚合酶0.4μL(均购自MBI Fermentas,Lithuania公司),引物PS5+PS15(扩增的片段为1 340bp左右)各0.44μmoL/L,引物 SP11-L+SP11-R′(扩增的片段为300bp左右)各0.36μmoL/L,ddH2O补充至终体积25μL。热循环参数为:94℃ 3min;94℃ 30s,53℃ 60s,65℃ 90s,33个循环;65℃ 10min,1个循环;4℃保存。水平胶检测表明,这个多重PCR标记能成功区分3种基因型(见图2)。
　　2.2.2以分子标记ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)组成的双重PCR对125份材料中被ISLG标记的89份材料进行扩增。其PCR反应体系:100ng DNA为模板,10×PCR buffer 3μL,2mmoL/L MgCl2,0.24 mmoL/L dNTPs,1.0U Taq DNA聚合酶0.4μL(均购自MBI Fermentas,Lithuania公司),SCAR引物ISLGb(扩增的片段为1 250bp左右)各0.40μmoL/L,SCAR引物SP11a(扩增的片段为430bp左右)各0.40μmoL/L,ddH2O补充至终体积25μL。热循环参数为:94℃3min;94℃ 30s,59℃ 60s,65℃ 90s,33个循环;65℃ 10min, 1个循环;4℃保存。所得到基因型结果见图3。
　　通过整合上述分子标记,得到了1套SCAR分子标记体系(见表1)。包括2个多重PCR分子标记:①ISLG(PS5+PS15)和SP110(SP11-L+SP11-R')用于鉴别ISLG和IISP11b;②ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLGb和IISP11。还有1个单PCR分子标记:SRKa(S40-5+S60-2)用于鉴别IISRKa[1]。
　　
　　3 结论与讨论
　　
　　随着现代分子生物学的发展以及S单倍的鉴定,很多S位点连锁的分子标记被相继发展出来,利用分子标记技术来判断自交不亲和性将会更加准确[6]。最初得到的SLG6的cDNA克隆后,人们便将它或其片段作为探针,同时对多种不同的S单倍型的全基因组DNA进行RFLP分析获得了可以准确推断出各种S单倍型的RFLP标记,从而初步建立了一种用DNA分子标记快速测定S单倍型的方法。
　　本研究基于前人的研究成果,首先发展了1个SCAR分子标记ISLGb用于区分ISLGa和ISLGb,接着组合了2对多重PCR分子标记并对它们进行了重复验证,发现这些结果与张幸果[1]的是一致的。最后,建立和完善了1套用于区分甘蓝型油菜S单倍型的SCAR分子标记体系。这套标记体系由2个多重PCR和1个单PCR标记组成:① ISLG(PS5+PS15)和SP110(SP11-L+SP11-R')用于鉴别ISLG和IISP11b;② ISLGb(ISLGb-L+PS15)与SP11a(SP11-L+SP11-R)用于鉴别ISLGb和IISP11;③ SRKa(S40-5+S60-2)用于鉴别IISRKa。后来尝试发展区别IISLGa和IISLGb的SCAR分子标记,但由于两者的核苷酸序列的相似性高达99%,未能成功发展,目前只能通过CAPS分子标记区分IISLGa和IISLGb[5]。
　　
　　4参考文献
　　
　　[1]马朝芝,傅廷栋,杨光圣,等.甘蓝型油菜双低自交不亲和系的选育[J].华中农业大学学报,1998(3):211-213.
　　[2]张幸果.甘蓝型油菜自交不亲和初步研究[D].武汉:华中农业大学,2007.
　　[3]NISHIO T,KUSABA M,WATANABE M,et al.Registration of S alleles in Brassica campestris L by the restriction fragment sizes of SLGs[J]. Theor Appl Genet,1996(92):388-394.
　　[4] TANG J Y,ZHANG J F,MA C Z,et al.CAPS and SCAR markers linked to maintenance of self-incompatibility developed from SP11 in Brassica napus L[J].Molecular Breeding,2009,24(3):245-254.
　　[5] ZHANG X G,MA C Z,TANG J Y,et al.Distribution of S haplotypes and its relationship with restorer-maintainers of self-incompatibility in cultivated Brassica napus[J]. Theor Appl Genet,2008(117):171-179.
　　[6] 朱利泉,王小佳.利用S倍点多态性快速测定甘蓝自交不亲和性及其S等位基因系[J].植物学报,2000(6):595-599.
　　

转载注明来源:https://www.xzbu.com/8/view-9104401.htm