不同基因型花椰菜通用再生体系的构建

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　　摘 要：以不同基因型花椰菜的薹茎段为试验材料，筛选适宜花椰菜快速繁殖的培养基配方，构建适用于不同基因型花椰菜的离体再生体系。结果表明：用75%C2H5OH消毒15s后，7%NaClO消毒10min处理不同基因型花椰菜的外植体，污染率为0，且茎段不变色、不影响后期分化;6-BA是理想的花椰菜不定芽诱导的细胞分裂素，6-BA 1mg/L+IBA 0.5mg/L是最佳的不定芽诱导培养基;ZT 2mg/L+NAA0.1mg/L是最佳的促进不定芽快速生长的激素组合;6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L是最佳的不定芽继代增殖的激素组合;MS+IBA 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L是最佳的促进无菌苗生根的培养基。
　　关键词：花椰菜;基因型;再生体系
　　中图分类号 S635.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）（02-03）-0020-05
　　Construction of Universal Regeneration System of Different Genotypes of Cauliflower
　　Wang Lingmin et al.
　　（Institute ofTropical Eco-agriculture， Yunnan Academy of Agricultural Sciences/Yuanmou Dry-Hot Valley Botanical Garden， Yuanmou 651300， China）
　　Abstract：In this study， the stolon segment of different genotypes of cauliflower were used as materials to screen the medium suitable for the rapid propagation of cauliflower， and the in vitro regeneration system suitable for different genotypes of cauliflower was constructed. The results showed that the explants of various cauliflower varieties were treated with 75% C2H5OH for 15 s and 7% NaClO for 10 min. The contamination rate was 0， the stolon segmentl didn’t change color and affect the later differentiation. 6-BA was the optimum hormone for cauliflower adventitious bud induction.6-BA 1mg/L+IBA 0.5mg/L is the best adventitious bud induction medium; ZT 2mg/L+NAA 0.1mg/L is the best hormone combination to promote the rapid growth of adventitious buds;6 -BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L is the best combination of hormones for adventitious bud regeneration; MS+IBA 0.1 mg/L+IAA 0.1 mg/L is the best medium for promoting sterile shoot rooting.
　　Key words： Cauliflower; Genotype; Regeneration system
　　花椰菜（Brassica oleracea L. var. botrytis L.）是一二年生的草本植物，屬十字花科芸薹属甘蓝种以花球为产品的一个变种。近年来，由于花椰菜中含量较高的葡萄糖苷具有抗癌作用[1-2]，且营养丰富、口感脆嫩，深受广大消费者的喜爱，成为了世界范围内重要的蔬菜作物之一。传统的花椰菜育种常采用常规的杂交育种手段，需要花费大量的人力物力才有可能得到具有优良性状的亲本，不仅耗时长、效率低，且难以创制新的种质。基因工程育种是定向对花椰菜进行遗传改良，为花椰菜新品种的选育提供了一条有效的途径。以基因工程为核心的育种手段解决了许多传统育种不能突破的问题[3]，而建立其离体再生体系是花椰菜进行遗传转化的重要一环。
　　目前，对于花椰菜离体再生体系的研究，国内外以花球、子叶、下胚轴、叶片、薹茎段、腋芽等为材料，虽已建立了一些花椰菜品种的再生体系，如建立了147花椰菜和庆农65天[4]、白灵花椰菜[5]、春秋花椰菜[6]、花椰菜雄性不育系[7-8]以及花椰菜自交不亲和系160（中晚熟）[9]等品种的再生体系，但由于花椰菜品种众多，不同品种间基因型存在差异，前人多是针对某一特定品种建立其再生体系，而在其他种类的花椰菜运用中未必适合。在进行花椰菜遗传转化研究时，适用于不同基因型花椰菜的再生体系的构建能使研究更加方便、快捷。
　　本研究以24个基因型花椰菜为研究对象，筛选适宜花椰菜离体组织快速繁殖的通用培养基，构建适用于不同基因型花椰菜的离体再生体系，为后续花椰菜遗传转化的研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料 供试材料有云松花1号、云松花8号、云花菜11710、云花菜11714、YNb-1、YNb-7、庆农65天、庆农90天、庆农100天、夏雪40天、台松90天、优松60、白玉88、C1716-2、C1718-1、C1724-1、C1725-1、FJW7-1、泰国耐热40天、12-1、12-2、庆美80天、华美90天等24个花椰菜品种（见表1），均来自云南省农业科学院热区生态农业研究所试验地。 　　1.2 培养基及培养条件 以MS为不定芽诱导、不定芽快速生长、继代增殖及生根的基本培养基。培养基中均附加蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH值5.8。于121℃高壓灭菌锅灭菌25min。接种后将外植体置于25℃培养箱中，光照强度2500lx，光照时间12h/d。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 外植体消毒 从供试植株上采取新鲜健康薹茎段，流水冲洗10min，再用洗涤剂清洗5min，洗净后吸水纸吸干，用75%乙醇消毒数秒或0.1%升汞消毒数分钟，无菌水清洗3遍，再用7%次氯酸钠消毒数分钟后，无菌水清洗3遍，用无菌吸水纸吸干水分备用，接种时，每个处理每个基因型接种5瓶，每瓶接种5个外植体，5d后统计污染率，10d后统计褐化率。同一基因型在同一处理中的污染数用wn表示，n表示1～24个基因型花椰菜，若在同一处理中有一个外植体污染则wn=1，若同一处理中外植体无污染则wn=0，平均污染率W（%）=（w1+w2+w3+……+w24）/24×100。同一基因型在同一处理中的褐化数用hn表示，若同一处理中有1个外植体褐化则hn=1，若同一处理中外植体无褐化则Hn=0，平均褐化率H（%）=（h1+h2+h3+……+h24）/24×100。
　　1.3.2 不定芽诱导培养 将不同基因型花椰菜消毒后的薹茎段切成带一个叶柄的小段接入不同的分化培养基中，每个培养基接种5瓶，每瓶5个外植体，3次重复，接种10d后统计24个基因型花椰菜的不定芽分化情况。以不定芽2叶1心，形态正常为计数标准，统计不同基因型花椰菜在不同处理中的不定芽分化情况，用pn表示不定芽分化情况，在同一处理中，若该基因型花椰菜分化率大于70%，则视为该基因型花椰菜在此培养基上成功分化，则pn=1，若该基因型花椰菜分化率小于70%，则视为该基因型花椰菜在此培养基上未成功分化，则pn=0;24个基因型花椰菜能在不同处理中成功诱导出不定芽的比率用P表示，P（%）=（p1+p2+p3+……+p24）/24×100。用qn表示不同基因型花椰菜诱导出不定芽的玻璃化情况，若该基因型花椰菜在此培养基上诱导出的不定芽玻璃化率占该基因型外植体接种总数的10%，则视为该基因型花椰菜在此培养基上玻璃化，则qn=1，反之qn=0;24个基因型花椰菜在不同处理中不定芽玻璃化的比率用Q表示，Q（%）=（q1+q2+q3+……+q24）/24×100。
　　1.3.3 不定芽快速生长培养 将上述诱导出的不定芽单株分离后接入不定芽快速生长培养基，每个培养基接种5个不定芽，每个基因型接种5瓶，重复3次，待不定芽茎干生长至2～3cm左右即可用于继代增殖，7d后统计不定芽生长情况，用kn表示不同基因型花椰菜在同一处理中不定芽的快速生长情况，以7d后接种的同一个基因型花椰菜内不定芽长至1.5～2cm的数量大于接种数50%为计数标准，大于50%则视为该基因型花椰菜在该培养基上快速生长，则kn=1，反之kn=0;24个基因型花椰菜能在不同处理中不定芽快速生长的比率用K表示，K（%）=（k1+k2+k3+……+k24）/24×100。用tn表示不同基因型花椰菜诱导在快速生长培养基中不定芽的玻璃化及畸形苗情况，若该基因型花椰菜在此培养基上不定芽玻璃化及畸形苗率占接种总数的10%，则视为该基因型花椰菜不定芽在此培养基上玻璃化及畸形，则tn=1，反之tn=0;24个基因型花椰菜在不同处理中不定芽玻璃化及畸形苗的比率用T表示，T（%）=（t1+t2+t3+……+t24）/24×100。
　　1.3.4 不定芽继代增殖培养 将上述生长至2～3cm左右的无菌苗去茎尖，切成1cm左右的小段，每段至少带有1～2叶片，接入继代增殖培养基，每个培养基接种5个茎段，每种基因型的花椰菜接种5瓶，3次重复;将无菌苗去掉的茎尖部分继续接入不定芽快速生长培养基中继续生长，一周后统计统计不同基因型花椰菜从在各处理中不定芽继代增殖的情况。用gn表示不同基因型花椰菜在同一处理中无菌茎段的增殖情况，以该基因型花椰菜在同一处理中80%的茎段长出腋芽为计数标准，大于80%则视为该基因型花椰菜在此处理中成功继代增殖，gn=1，反之则gn=0， 24个基因型花椰菜能在不同处理中无菌茎段继代增殖的比率用G表示，G（%）=（g1+g2+g3+……+g24）/24×100。用fn表示不同基因型花椰菜在继代增殖培养基中不定芽的玻璃化及畸形苗情况，若该基因型花椰菜在此培养基上不定芽玻璃化及畸形苗率占接种总数的10%，则视为该基因型花椰菜不定芽在此培养基上玻璃化及畸形，则fn=1，反之fn=0;24个基因型花椰菜在不同处理中不定芽玻璃化及畸形苗的比率用F表示，F（%）=（f1+f2+f3+……+f24）/24×100。
　　1.3.5 生根培养 将生长至2cm左右的无菌苗接入生根培养基，每个培养基接种5棵无菌苗，每个处理接种5瓶，重复3次，10d后统计无菌苗生根情况。用yn表示不同基因型花椰菜在同一处理中无菌苗的生根情况，以该基因型花椰菜在同一生根处理培养基中90%的无菌苗生根为计数标准，生根数大于90%则视为该基因型花椰菜无菌苗在此处理中成功生根，yn=1，反之则yn=0，24个基因型花椰菜能在不同处理中无菌苗生根的比率用Y表示，Y（%）=（y1+y2+y3+……+y24）/24×100。
　　1.3.6 数据分析 数据采用SPSS 18.0软件分析，采用邓肯法在0.05水平进行差异显著性检验。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同消毒组合筛选 由表2可知，75%C2H5OH和0.1%HgCl对外植体污染率的控制有明显效果，且随着浓度的升高，污染率逐渐降低，但薹茎段对HgCl较为敏感，消毒后外植体均出现不同程度的褐化，从而影响了不定芽的分化。而75%C2H5OH对花椰菜离体薹茎段的消毒效果较好，但若消毒时间超过30s，薹茎段的褐化情况明显加重。通常情况下，在对外植体进行消毒接种后，外植体若未消毒干净，接种后的第3天培养基上即会出现真菌菌落;若为细菌污染，第5天在外植体与培养基接触部位即会出现细菌菌落，7d后若培养基中未出现任何菌落，则表示外植体已消毒干净。其中，75%C2H5OH消毒15s+7%NaClO消毒10min的消毒组合，均能将24个基因型花椰菜外植体消毒干净，同时不影响后期不定芽的分化。 　　2.2 不定芽诱导培养基的筛选 在薹茎段诱导不定芽过程中，5d左右腋芽位置分化出芽，10d左右芽长至2cm（图1），即可与外植体分离并接入不定芽快速生长培养基中。从表3可以看出，在不同的激素组合处理下，都有不同數量基因型花椰菜诱导出不定芽，但不定芽诱导率存在显著性差异。6-BA对花椰菜离体薹茎段诱导不定芽的能力显著高于ZT与TDZ。但随着6-BA浓度达到2～3mg/L时，诱导的不定芽畸形或玻璃化情况严重，而ZT与TDZ在不定芽诱导方面无显著差异，这可能是由于花椰菜对6-BA较为敏感，故低浓度的6-BA就能促进大部分的花椰菜分化，而浓度过高则引起花椰菜激素中毒从而导致不定芽玻璃化及畸形。故较好的组合应为处理7：6-BA 1mg/L +IBA 0.5mg/L，可使95.83%基因型的花椰菜诱导出正常健壮的不定芽;而24个基因型花椰菜中，晚熟品种云花菜11714在处理7的培养基中不定芽诱导率较低，只有少数正常苗，当6-BA的浓度升高至2～3mg/L时，诱导的不定芽数量增多，但大部分为玻璃化苗，需在不定芽刚分化出的5d内转入ZT培养基缓苗，针对此基因型花椰菜的最佳诱导培养基需进一步研究。
　　2.3 不定芽快速生长培养基的筛选 从表4可以看出，不同基因型花椰菜的不定芽快速生长情况在不同的激素浓度组合处理间存在显著性差异，ZT和6-BA在促进花椰菜不定芽生长方面无显著性差异，但花椰菜对6-BA较为敏感，6-BA在促进不定芽生长过程中易引起植株玻璃化及形成畸形苗，原因可能是前一步利用6-BA作为细胞分裂数诱导不定芽分化，而后又利用6-BA促进其快速生长，造成6-BA在植株体内过度积累而导致玻璃化及畸形苗;而ZT在促进不定芽生长时，无菌苗生长快，形态正常。故选择处理2：ZT 2mg/L+NAA0.1mg/L作为促进不同基因型花椰菜不定芽快速生长的最佳培养基配方。通常情况下，2叶1心的花椰菜不定芽接入快速生长培养基7d后，茎达到1.5～2cm左右即可进行继代增殖。
　　2.4 不定芽继代增殖培养基的筛选 由薹茎段诱导出的不定芽经过快速生长培养基培养后，得到健壮的花椰菜无菌苗，接入继代增殖培养基7d后，从腋芽位置长出不定芽（图3）。从表5可以得出，处理4：6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L的不定芽继代增殖率显著高于其他处理，且不定芽玻璃化及畸形苗率也较低。值得注意的是，用6-BA作为细胞分裂素诱导不定芽增殖时，当不定芽长至0.5cm左右时就应及时转入不定芽快速生长培养基中，避免不定芽继续生长后玻璃化。
　　2.5 生根培养基的筛选 无菌苗接入生根培养基后，4d左右最先在接入处理4的培养基中无菌苗根部出现白色点状凸起，随后3d有不定根长出，接种10d左右，不定根长至1～2cm（图4）。从表6可以看出，处理4中生根率显著高于其他处理，接种的24个基因型花椰菜生根率为100%，而处理1生根率也相对较高，但通过处理1生根的无菌苗根部会产生0.3～0.5cm左右的愈伤组织后再长出不定根，此不定根在后期移栽清洗培养基时易脱落，无菌苗根部愈伤组织也极度影响无菌苗的成活率;而通过处理4生根的无菌苗，生根快，不定根多、细长且不易脱落，移栽易成活。因此，最终选择MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L IAA作为适合不同基因型花椰菜离体快繁的最佳生根培养基。
　　3 讨论与结论
　　众多研究表明，基因型是影响植株脱分化和再分化的重要因子[10]，总的来说，花椰菜属于易于培养的植株种类，在不同激素组合及配比下极大部分基因型的花椰菜都易脱分化，只是分化效率高低不一。林珲等[4]在建立2个不同品种花椰菜的再生体系时得到在激素配比相同的条件下，不同品种的花椰菜不定芽分化率不相同;而李敏等[11]对多个花椰菜进行研究后得出，不同品种的花椰菜其最适宜分化的激素种类组合及浓度配比也各不相同。而本研究构建的通用再生体系，虽不能使各基因型花椰菜都达到最佳的分化效率，但各基因型花椰菜都能在同一培养基中达到70%以上的分化率，且大部分基因型的花椰菜分化率在90%以上，增殖系数也较高。本研究发现，早熟及中熟品种的花椰菜脱分化较容易，增殖系数高，而晚熟品种相对难诱导，出现外源激素浓度低脱分化困难，而外源激素高诱导出的不定芽易玻璃化和畸形的情况，针对此类基因型花椰菜需进行后续研究。
　　植株生长和分化是内源激素和外源激素共同作用的结果。从前人对不同基因型的花椰菜研究中发现，最佳的诱导培养基配方中细胞分裂素多为6-BA，但浓度存在显著差异，从0.5mg/L到3mg/L不等[4-9]。本研究发现，6-BA在花椰菜不定芽诱导方面起到了积极的促进作用，但浓度高于2mg/L时，部分基因型花椰菜诱导出的不定芽易出现畸形和玻璃化现象，而ZT在诱导脱分化时较6-BA次之，但在促进花椰菜不定芽生长时效果较好，生长快，不易出现畸形苗。因此，在建立不同基因型花椰菜离体再生体系时，可选择6-BA诱导不定芽分化，选择ZT进行后续不定芽促生长。用6-BA诱导茎段进行继代增殖时，发现幼嫩茎段主要是从腋芽处分化不定芽，而稍老壮的茎段则主要是从茎段底部分化大量丛芽;且在进行生根培养时也出现幼嫩茎段生根慢，而稍老壮茎段生根较快，根系长的现象，推测可能是因为不同时期的植株或组织其内源激素水平不同而引起外植体分化差异，后续将对植株内部激素水平差异方面进行研究，探究其引起外植体不同分化情况的机理。
　　参考文献
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　　（责编：张宏民）
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