一种呋喃西林酶联免疫检测方法的建立

来源:用户上传      作者:李泳宁 彭臻菲 黄慧 蔡美虹 林清清

　　摘要[目的]建立一种饲料中呋喃西林酶联免疫检测方法。[方法]利用制备的人工抗原和高特异性单克隆抗体，采用间接竞争酶联免疫技术建立呋喃西林检测方法。[结果]在优化条件下，检测抗原浓度为10 μg/mL，抗体稀释度为1∶5 000。呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有较好的线性关系（R2=0.998 7），IC50为1.43 ng/mL。与呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲的交叉反应率低于0.5%。饲料样品中添加呋喃西林的平均回收率为87.5%～96.0%，变异系数为6.1%～9.7%。[结论]该方法快速、准确、灵敏，可用于饲料中呋喃西林的分析检测。
　　关键词呋喃西林;酶联免疫检测;单克隆抗体;饲料
　　中图分类号R446.6文献标识码A
　　文章编号0517-6611（2020）04-0193-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.056
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Establishment of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Determination of Nitrofurazone
　　LI Yong-ning，PENG Zhen-fei，HUANG Hui et al（Fujian Health College，Fuzhou，Fujian 350101）
　　Abstract[Objective]To establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） for the determination of nitrofurazone in feed.[Method]The artificial antigen and the high specificity monoclonal antibodies against nitrofurazone were prepared.An indirect competitive ELISA for the determination of nitrofurazone in feed was established.[Result]The optimization of ELISA parameters were that the concentration of antigen was 10 μg/mL and the dilution multiples of antibodies was 1∶5 000.The good linear range was 0.1-10.0 ng/mL（R2=0.998 7） and IC50 was 1.43 ng/mL.The cross-reactivity （CR） rate was less than 0.5% with other nitrofurans such as furazolidone，furaltadone，furantoin and semicarbazide.The average recovery from artificially contaminated nitrofurazone of feed was 87.5%-96.0%，with coefficient of variation （CV） was 6.1%-9.7%.[Conclusion]The method developed is rapid，accurate and sensitive and will be helpful for rapid screening for nitrofurazone in feed.
　　Key wordsNitrofurazone;Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）;Monoclonal antibody;Feed
　　硝基呋喃类药物是一类具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫均有作用[1]。呋喃西林是硝基呋喃类代表药物之一，具有杀菌能力强、抗菌谱广和价格低廉等优点，曾被广泛使用在养殖业中。但越来越多的研究表明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有一定的毒性作用，可诱发癌症[2]，尤其是呋喃西林代谢物氨基脲对人体有致癌、致畸胎等副作用[3]。因此，越来越多的国家严禁使用呋喃西林药物，而2002年我国农业部193号公告也禁止使用硝基呋喃类药物在食用动物上。但是由于呋喃西林使用效果明显、价格便宜，目前仍然存在违规用药情况。因此，对呋喃西林的检测显得尤为重要。
　　目前，呋喃西林的方法主要有高效液相色谱法[4-5]和液相色谱-质谱联用法[6-7]。其中，高效液相色谱法可靠性较强且重复性好，广泛应用于饲料以及动物食品中的残留检测，最低检出限可达1 μg/kg;液相色谱-质谱联用法具有高灵敏度、高选择性的特点，最低检出限可达0.50 μg/kg，但仪器设备要求高，检测费用成本昂贵。近年来快速发展的免疫检测法具有检测速度快、灵敏度高和选择性强等优点，广泛应用于各类药物残留的检测中，也是目前检测的重要方向。由于呋喃西林在动物体内代谢迅速，而其代谢物可在机体内稳定存在，一般采用检测呋喃西林代谢物来判定食用动物中是否存在药物残留，而对呋喃西林的免疫学检测方法则报道较少。该研究利用合成的人工抗原和高特异性抗呋喃西林单克隆抗体建立呋喃西林免疫检测方法，并进行饲料中呋喃西林的检测方法研究，可望用于饲料样品的大量筛查。
　　1材料与方法
　　1.1材料与仪器呋喃西林（nitrofurazone，NFZ）、呋喃唑酮和呋喃妥因购自东京化成工业株式会社;呋喃它酮和呋喃西林代谢物氨基脲购于德国Dr.Ehrenstorfer公司;卵清蛋白（ovalbumin，OVA）为Worthington公司产品;四甲基联苯胺（3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine，TMB）为TIANGEN公司产品;HRP标记羊抗小鼠IgG购自北京庄盟公司。其他试剂均为分析纯。NFZ-OVA人工抗原和抗呋喃西林單克隆抗体由福建卫生职业技术学院生物医药工程中心制备。SpectraMax M3型多功能酶标仪，美国Molecular Devices公司。 　　1.2检测方法
　　1.2.1检测抗原及单抗工作浓度的优化。
　　检测抗原及单抗的工作浓度采用方阵实验法，将单抗和检测抗原分别进行系列稀释，检测抗原浓度分别为1、5、10、20、30 μg/mL，单抗稀释倍数从1 000到25 000进行梯度稀释。以NFZ-OVA为检测抗原，采用间接非竞争ELISA法测定。以吸光度在1.0左右对应的抗原抗体浓度作为检测抗原和单抗最佳工作浓度。
　　1.2.2间接竞争ELISA标准曲线的建立。
　　呋喃西林采用甲醇溶解，再进一步用缓冲液稀释成不同浓度（1 000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 ng/mL）标准液，在包被检测抗原的酶标板微孔中分别加入50 μL不同浓度的标准品溶液和50 μL抗呋喃西林单克隆抗体，37 ℃振荡孵育2 h。反应洗涤后每孔再加入100 μL HRP-羊抗小鼠 IgG，37 ℃孵育1 h。反应结束后，每微孔中加入100 μL底物TMB，37 ℃避光反应15 min;每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A450）。以呋喃西林浓度的对数值为横坐标、竞争抑制率为纵坐标绘制标准曲线，得出标准回归方程。A0为不加呋喃西林的吸光度，A为添加呋喃西林的吸光度，抑制率按公式：
　　抑制率=（A0-A）/A0×100%计算。在标准竞争曲线上计算出抑制率为50%时呋喃西林的标准浓度作为竞争抑制率IC50。
　　1.2.3交叉反应性分析。将NFZ结构类似物呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲梯度稀释，进行间接竞争ELISA测试，计算出交叉反应率（CR）：CR=IC50呋喃西林/IC50呋喃西林结构类似物×100%。
　　1.2.4饲料样品检测处理。
　　从市场收集饲料样品2个。准确称取1.000 g样品，加入10 mL 70%乙醇，超声提取20 min，滤纸过滤，收集滤液1。滤饼再用10 mL 70%乙醇超声提取，过滤后收集滤液2。合并2次收集的滤液，浓缩至尽干。加入1 mL 10%甲醇进行溶解后备用。采用间接竞争ELISA进行检测，根据标准回归方程，计算呋喃西林含量。
　　1.2.5样品加标回收率测定。
　　选择未检出呋喃西林的饲料样品进行加标回收率试验。分别向1.000 g饲料样品中添加呋喃西林标准品（标准品稀释成液体后加入），使其样品中含有1.0、5.0和10.0 ng呋喃西林，按“1.2.4”的方法进行提取。取50 μL提取液用于ELISA检测，根据呋喃西林标准品竞争抑制标准曲线，计算加标回收率和变异系数（CV）。
　　2结果与分析
　　2.1检测抗原及单抗工作浓度的确定
　　检测抗原浓度和抗体质量及其稀释倍数是影响ELISA检测的最主要因素。该试验采用方阵滴定法确定检测抗原浓度与抗体稀释倍数的组合。试验结果表明，检测抗原浓度为10 μg/mL，抗体稀释倍数在1∶5 000时A450值在1.0附近，故选择此条件为后续试验参数。
　　2.2间接竞争ELISA标准曲线的建立
　　将呋喃西林标准品溶液稀释成不同浓度（1 000、500、100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 ng/mL）标准液，按照间接竞争ELISA的方法进行测定，结果如图1所示。从图1可以看出，呋喃西林浓度为0.1～10.0 ng/mL时具有较好的线性关系，在此范围内建立间接竞争ELISA的标准曲线，其标准方程为y=-37.847x+55.916（R2=0.998 7）。当抑制率为50%时，IC50值为1.43 ng/mL。
　　2.3交叉反应率的测定
　　将呋喃西林的结构类似物呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲的标准品溶液稀释成梯度浓度标准品，与检测抗原NFZ-OVA做间接竞争ELISA测试。结果发现，福建卫生职业技術学院生物医药工程中心制备的抗呋喃西林单克隆抗体除了与呋喃唑酮的交叉反应率达到0.48%外，与呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲的交叉反应率均低于0.1%，可见该中心制备的单克隆抗体具有较好的特异性。
　　2.4样品中呋喃西林加标回收率试验
　　从市场收集的2个饲料样品，经提取后，采用间接竞争ELISA法进行检测，结果发现2个饲料样品均未检测到呋喃西林。从饲料样品中准确称取1.000 g，向样品中添加呋喃西林标准品，使其样品中含有1.0、5.0、10.0 ng呋喃西林。提取后采用间接竞争法进行测定样品的呋喃西林含量，计算饲料样品的呋喃西林回收率，结果发现（表1），在2个饲料样品中添加3个浓度呋喃西林标准品的回收率为87.5%～96.0%，回收率较高;CV值为6.1%～9.7%，具有较好的重复性。该试验结果表明该研究建立的间接竞争ELISA检测方法具有较高的准确度和重复性。
　　3讨论与结论
　　近年来，在食用动物中检出硝基呋喃类代谢物的报道仍时有发生，特别是在水产动物产品中，仍可检测硝基呋喃类的代谢物。吴旭等[8]随机抽样检测2017和2018年淮安地区的小龙虾产品，结果发现，呋喃西林代谢物残留检出率高达63%。张桂芳等[9]随机抽样采集烟台市售养殖虾样品78份，对样品中19种抗生素残留的污染水平进行检测，结果检测出呋喃西林代谢物阳性样品5份。可见，硝基呋喃类药物仍有被非法使用在养殖业中，特别是在水产养殖中，因此对上游饲料的监控检测仍是十分必要。
　　目前，多数研究也集中于呋喃西林代谢物的检测方法，而对呋喃西林检测技术研究的较少，因此，近年来也相应开发了一些针对呋喃西林及其代谢物的新型检测技术。
　　陈宗保等[10]建立了以巯基丁二酸改性纳米金新型富集技术-毛细管电泳法同时测定硝基呋喃类药物残留，在最优分离条件下，呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林的最低检测限分别为3.7×10-7、4.2×10-7、2.2×10-7和4.3×10-7mol/L。许月明等[11]开发了一种ELISA 可视化微阵列芯片法检测蜂蜜中硝基呋喃类药物的残留量，呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因的检测灵敏度分别为0.20、0.05、0.07和0.15 μg/L。梁高道等[12]以磁微粒作为固相载体、化学发光作为检测信号建立了硝基呋喃类药物残留快速检测方法，其中呋喃西林氨基脲的IC50可达0.232 4 ng/mL。可见，快速、灵敏的检测方法仍然是目前研究的热点。 　　该研究利用制备的抗呋喃西林高特异性单克隆抗体，采用间接竞争酶联免疫技术建立呋喃西林检测方法。结果表明，呋喃西林在0.1～10.0 ng/mL具有较好的线性关系（R2=0.998 7），IC50为1.43 ng/mL。与呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林代谢物氨基脲的交叉反应率均低于0.5%。饲料样品中添加3个浓度呋喃西林的回收率为87.5%～96.0%， CV值为6.1%～9.7%。可见该方法快速、准确、灵敏，可用于饲料中呋喃西林的分析检测。
　　参考文献
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