肝豆灵对高铜负荷大鼠空间学习记忆能力及神经干细胞ROS水平的影响

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　　【摘 要】 目的：观察肝豆灵对高铜负荷大鼠空间学习记忆能力及胎鼠神经干细胞（neural stem cell，NSC）活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的影响。方法：75只SD大鼠适应性喂养7d，随机分为对照组，模型组，肝豆灵处理高、中、低剂量组，肝豆灵处理组分别给予1.92g/kg/d、0.96g/kg/d、0.48g/kg/d药物血清灌胃，对照组以等体积纯净水灌胃，7d后观察SD大鼠在T臂迷宫试验中空间学习记忆能力的变化。于无菌条件下取孕14d ICR小鼠胎鼠海馬组织，分为对照组、高铜模型组和高、中、低剂量肝豆灵片处理组，对照组在液体培养基中加入10%的SD大鼠空白血清，模型组用含10%的SD大鼠空白血清铜负荷培养基培养，肝豆灵低、中、高剂量组予以3种不同剂量配制的10%的肝豆灵药物血清铜负荷培养基培养，以流氏细胞仪检测神经干细胞ROS水平。结果：行为学试验，模型组和小剂量治疗组的进入电刺激区的时间明显降低，经过药物治疗后，进入电刺激区的时间（S）明显增加。ROS水平检测，模型组高于对照组（P<0.01），肝豆灵组低于模型组（P<0.05），高于正常组（P<0.05）。结论：化痰祛瘀方肝豆灵可降低神经干细胞中ROS的水平并改善高铜负荷大鼠空间学习记忆能力。
　　【关键词】
　　Wilson病;认知功能;肝豆灵;T臂水迷宫;神经干细胞
　　【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）5-0013-04
　　Effects of Gandouling on Spatial Learning and Memory Ability
　　and ROS level of Neural Stem Cells in Copper-stressed Mice
　　KUANG Chunjun1 DONG Ting2* ZHOU Ping1 LI Xiuying1 TIAN Liwei1 HUANG Peng2
　　1. Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230038，China;
　　2. Encephalopathy Center，First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230031，China
　　Abstract：
　　Objective To observe the effects of Gandouling on spatial learning and memory in rats with high copper load and the effects of Gandouling on ROS levels in fetal neural stem cells.Method Adaptability of 75 SD rats fed，after 7 days，were randomly divided into control group，model group，hepatic bean spirit high，medium and low dose group，treatment group were given liver beans spirit of 1.92g/kg/d，0.96g/kg/d，0.48g/kg/d drug serum to fill the stomach，the control group with pure water to fill the stomach，such as volume seven days to observe SD rats in T arm maze test the change of spatial learning and memory ability.In a sterile conditions get pregnant 14d fetal rat hippocampus，ICR mice were divided into control group，high copper model group and high，medium and low dose hepatic bean spirit treatment group，control group to join in the liquid medium blank serum，10% of the SD rats model group with blank SD rats serum copper containing 10% load medium，hepatic bean spirit high，medium and low dose group to be three different dose makes up 10% of the cultured liver beans spirit drug serum copper load medium，flow meters cells in detecting neural stem cells ROS levels.Result In the behavioral test，the time to enter the electrical stimulation area in the model group and the low-dose treatment group decreased significantly，and the time to enter the electrical stimulation area（S）increased significantly after drug treatment.ROS level in the model group was higher than that in the control group（P<0.01），lower than that in the model group（P<0.05），and higher than that in the normal group （P<0.05）.Conclusion Gandouling Decoction for Resolving Phlegm and Removing Stasis can reduce ROS level in neural stem cells and improve spatial learning and memory ability of rats with high copper load. 　　Key words：Wilson disease;Cognitive function;Gandouling;T-arm water maze;Neural stem cells
　　Wilson病（Wilsons disease，WD），即肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration，HLD），是ATP7B基因缺陷引起的铜代谢障碍疾病。患者因基因缺陷不能清除体内多余的铜，使铜离子沉积于脑部、肝脏、肾脏、皮肤、眼部等脏器系统，使各组织脏器铜中毒受损而出现多样的临床表现。铜作为强氧化剂，可激活自由基，促进ROS的产生[1]，诱发氧化应激反应，使神经细胞凋亡。铜沉积脑部，神经系统受损，出现进行性智力减退[2-3]、精神异常等症状。在祖国医学研究中，將WD以认知能力下降为主要临床表现的辨病为“痴呆病”，其中“痰瘀互结型”易出现认知障碍。安徽中医药大学第一附属医院脑病中心为WD患者研制的肝豆灵（Gan dou liang，GDL）具有化痰祛瘀作用，课题组前期研究发现肝豆灵能够明显改善WD患者认知障碍[4]，提高患者智力水平。课题组在WD病程研究过程中发现，NSC是高铜负荷的重要靶点，肝豆灵能抵抗高铜导致的NSC生长阻碍，从而发挥神经保护作用[5]。因此，本研究从动物、分子水平，利用课题组前期体外建立的高铜培养NSC模型[6]，予以药物“肝豆灵”干预，观察胎鼠海马组织NSC中ROS水平的高低，为探讨肝豆灵对高铜诱导的NSC损伤小鼠的神经保护作用及其分子机制提供研究基础。
　　1 实验材料
　　1.1 动物 体重200～220 g SD大鼠75只，SPF级，由安徽动物中心提供，许可证号为SCXK（皖）2014-002。大鼠于专用清洁实验室饲养1周，温度25℃，相对湿度50%～70%，模拟自然昼夜循环光照的非直射光线。孕14d ICR小鼠3只，适应性喂养后取胚胎海马组织，分离并培养NSC。
　　1.2 分组 SD大鼠随机分组为对照组，模型组，肝豆灵处理高、中、低剂量组，用药剂量根据成人每日使用剂量按照体表面积换算法换算，0.2mL/10g体重灌胃，每日1次。对照组、模型组以等体积生理盐水灌胃，两组均连续给药7d。肝豆灵剂量0.0075g/10g体重，每0.3g溶于8mL溶液，低剂量组为0.48g/（kg·d），中剂量组为0.96g/（kg·d），高剂量组为1.92g/（kg·d）。
　　1.3 实验材料、仪器与试剂 显微剪、显微镊、45度显微剪、线栓、普通刀柄、手术刀片、组织冲洗球，均由上海金粒器械公司提供;空调，海尔公司;湿度计，上海生工;纯水机，Millipore公司;T臂迷宫，友诚生物科技有限公司。胰蛋白酶、DMEM/F12 （1：1）液体培养基，HyClone 公司;胎牛血清、无血清培养添加剂N2，Gibco;重组人表皮生长因子，Peprotech;重组人碱性成纤维细胞生长因子，Peprotech;噻唑蓝，Amresco;二甲基亚砜，Sigma;ROS检测试剂盒，ThermoScientific;Trizol试剂，Invitrogen;核蛋白提取试剂盒，Sigma公司，DU800紫外可见分光光度计，美国贝克曼;细胞培养箱2306-2，美国Shellab;倒置显微镜DMLL，德国徕卡;Odyssey双色红外荧光成像系统，美国LI-COR。
　　1.4 药物 肝豆灵片。安徽中医药大学第一附属医院研制，0.3g/片，150片/盒，批号20150522。由石菖蒲、丹参、姜黄、莪术、郁金、黄连、大黄、金钱草等组成。
　　2 实验方法
　　2.1 行为学观察
　　2.1.1 原理 在动物心理学的实验研究中，迷宫是常用的一种仪器，迷宫任务具有明显的空间特征。在记忆类研究中，常用的是放射迷宫。T迷宫是依靠觅食动机诱导动物完成任务的一种迷宫实验，实验操作将大鼠放入迷宫的中央区域，然后在每个臂尽头的小洞放一小块食物，允许大鼠探究迷宫直到它收集到所有食物。适应迷宫后，在两条目标臂中随机选择一条臂末端放入食饵，关闭另一条臂。将动物放入起始箱，使其进入目标臂获取食饵，连续训练一段时间后进入正式实验。先是强迫训练，选择一条臂开放并放入食饵，另一条臂关闭，当动物进入有食饵的臂获得奖励后，将其马上放回主干臂，而后让其自由探索左右两臂，动物若进入无食饵的臂，记为一次“错误次数”，反之为“正确次数”，重复测试多次。统计总的正确率越高，潜伏期越短，表明动物工作记忆越好[7]。完成此任务大鼠需要依靠参照记忆、工作记忆[8]学会任务的规则。
　　2.1.2 方法 将大鼠放入起始箱，封闭闸门。打开闸门，大鼠进入主干臂，关掉一侧目标臂，强迫大鼠进入另一侧开放臂，成功奖励2粒食丸，5s内把大鼠放回主干臂，进行二次训练。开放两个目标臂，大鼠把两前肢和至少两后肢一只放于一个目标臂，则算作完成“一次选择”。大鼠折返回训练时进入过的臂则获得奖赏4粒食丸，记录一次正确选择，进入另一臂，没有奖赏，且将其限制在该臂内10s，记录一次错误选择。训练结束后，将大鼠放回笼内5～10min（同时试验其他大鼠），重复训练，每天8次。连续两天正确选择达15/16，开始试验。30d后不达标，则淘汰。记录大鼠进入电刺激区的时间（s）。
　　2.2 NSC分离、培养，ROS检测 无菌条件下取孕14d ICR小鼠胚胎海马组织，以胰蛋白酶解消化，放入含有0.7mg/mL卵蛋白的DMEM/F12（1∶1），机械吹散。在低温条件下于2000r/min离心细胞悬液5min，后洗涤沉淀;重悬细胞，浓度5000～10000/mL，予以悬浮培养。存活细胞予免疫细胞化学检查，以验证其是否都为Abcg2+的NSC。体外培养的NSC模型分为对照组、高铜模型组和高、中、低剂量肝豆灵片处理组。对照组在DMEM中加入10%的SD大鼠空白血清，模型组用含10%的SD大鼠空白血清铜负荷培养基（200μmol/L工作浓度）予以培养;肝豆灵低、中、高剂量组予以3种不同剂量配制的10%的肝豆灵药物血清铜负荷培养基培养。运用CellROXTM Deep Red Flow Cytometry AssayKit分离、收集、流式分选Agcg2+的NSC。5×105个/mL为各试验组检测用细胞浓度。将CellROX Deep Red reagent（终浓度为500～1000nmol/L）加入至样本中，于37℃的条件下避光孵育30～60min。于孵育末15min内，在每1mL样本中加1mmol/L SYTOX Blue Dead CellStain solution 1μL，进行流式分析。于激发光波长405nm处检测SYTOX Blue Dead Cell Stain，于635nm处检测Cell ROX Deep Red reagent，并分别于450/50BP和665/40BP的滤光片处收集荧光发射光。 　　3 统计学方法
　　利用SPSS22.0统计软件行统计学分析，数据以（x±s） 表示，组间比较用t检验及方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　4 结果
　　4.1 行为学结果 造模前，各组进入电刺激区的时间（s）差异无统计学意义（P>0.05）。治疗7d后，模型组和小剂量治疗组的进入电刺激区的时间（s）明显增加，经过药物治疗后，中、高剂量组进入电刺激区的时间（s）明显降低。结果见图1，表1。
　　4.2 NSC中ROS水平检测结果 模型组高于对照组（P<0.01），肝豆灵组高于对照组（P<0.05），低于模型组（P<0.05）。结果可见图2，表2。
　　5 小结
　　WD是基因缺陷引起的铜代谢障碍性疾病，铜离子沉积脑部过多产生神经毒性，使神经细胞受损凋亡，发为WD。铜在脑部沉积以壳核最为显著[9]。方向等[10]发现铜负荷大鼠学习定位能力下降，存在明显的学习记忆障碍。韩辉等[5]发现，高铜可降低小鼠海马神经干细胞数目。在ATP7B基因缺陷小鼠中，研究人员发现肝脏和脑部的呼吸链复合物I活性增加，而复合物II，III和IV活性则减弱。其中，呼吸链复合物I是线粒体产生ROS的主要来源[11]。铜离子促进细胞内ROS产生，诱发氧化应激反应，从而导致细胞死亡。Altman等[12]证实大脑具有神经再生能力，脑组织中存在着的NSC[13]，可很长时间保持静止状态，在大脑受到损伤时NSC会大量增生并向受损区域转移替代，而ROS是调控神经细胞数量的重要因素[14]。
　　WD的临床表现主要有精神障碍、认知下降、言语含糊、口涎不止、肝脾肿大、腹部水胀、肢体扭转、震颤等，祖国医学根据这些症状特点将WD归于“肝风”“积聚”“水肿”“痉病”“癫痫”“痴呆”“癫狂”“黄疸”“鼓胀”“癥瘕”“震颤”“瘈疭”等范畴。在发病机制认识方面，中医认为，肝豆状核变性系先天禀赋不足，或先天脾胃失养，或情志所伤，肝郁脾虚，或外感邪毒，铜毒内积，湿热蕴生，痰瘀相结，癥积成形。杨文明等[15]认为“铜毒”是WD发展过程中独特的病理基础，决定其发展方向。韩辉等[16]研究得出，WD发病前的证型为肝气郁结证、湿热内蕴证、痰瘀互结证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证。其中认知障碍易出现于痰瘀互结型。我院脑病中心研制的院内制剂肝豆灵片，由石菖蒲、郁金、丹参、姜黄、莪术、鸡血藤、黄连、大黄组成。有利胆排铜、清热解毒、化瘀软坚之效，石菖蒲开窍豁痰、醒神益智;黄连清热泻火解毒;郁金可利胆退黄、清心凉血;大黄，清热泻下，解毒利湿;姜黄、莪术与鸡血藤，活血行气;丹参活血祛瘀、清心除烦。王艳昕等[17]发现肝豆灵可减少海马神经细胞凋亡，保护脑神经。现代药理研究发现，石菖蒲可抑制神经细胞凋亡[18]，保护脑神经。丹参提取物丹参酮ⅡA可减少caspase-3得表达实现其抗凋亡的机能，而保护神经细胞[19]。大黄可清除离体大鼠脑中的超氧自由基，抑制超氧化物歧化酶的生成，改善学习记忆功能。鸡血藤可提升脑组织ATP酶活性，改善脑细胞代谢障碍[20]。黄连可提高机体抗氧化能力[21]，降低ROS，保护神经细胞。郁金、莪术、姜黄的提取物姜黄素也有抗氧化效应[22]。实验结果提示，铜负荷使小鼠NSC中ROS水平明显上升，大鼠进入电刺激区的时间明显上升，经肝豆灵干预后，中、高剂量组小鼠NSC中ROS水平明显下降，大鼠进入电刺激区时间明显减少。可推测，不同剂量的肝豆灵可通过降低NSC中的ROS水平，对NSC高铜负荷模型有一定的修复作用。董婷[4]认为，肝豆灵是干扰了NSC中Nrf2的水平，降低了ROS，进一步阐述了肝豆灵作用于NSC的作用机制。
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　　（收稿日期：2019-12-13 编辑：陶希睿）
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