环链棒束孢(Isaria cateniannulata)杀虫缓释剂的制作

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　　摘要：以环链棒束孢孢子粉为原材料，海藻酸钠/明胶/淀粉作为包埋剂，采用包埋法制作一种环链棒束孢杀虫缓释剂，探究环链棒束孢孢子粉最适添加量以及缓释剂壁材的最优配比。结果表明，当孢子粉加入量为0.1 g/mL时，缓释剂颗粒大小均匀，粒径约为1.86 mm，成球率达到96.85%，释放速率平稳，在7 d释放程度达到66.99%。过高或过低芯材比例均会降低小球的性能。3%海藻酸钠/0.5%明胶/0.5%淀粉为包埋剂制作出的缓释剂与4%海藻酸钠和2%海藻酸钠/2%明胶为包埋剂所制作出的缓释剂相比，小球耐受度最高，承重力可达3.53 g，载药量增至4.08×109 CFU/g，包埋率增至93.78%。
　　 关键词：环链棒束孢;海藻酸钠;包埋剂;缓释剂;包埋率;孢子粉
　　 中图分类号： S482.91;S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）03-0119-05
　　环链棒束孢别称环链拟青霉，是一种重要的虫生真菌，在森林生态中的数量和分布仅次于白僵菌[1]。在1976—1977年调查害虫病原微生物时，从罹病茶树害虫中分离得到的病原真菌大多数为拟青霉。梁宗琦经培养鉴定发现有2个新种，其中一种为环链棒束孢[2]。目前研究发现，环链棒束孢具有一定杀虫作用：何劲等研究发现，环链棒束孢相较于玫烟色拟青霉、蝉拟青霉和细脚拟青霉对小菜蛾的室内毒力最强[3];李丰伯等在对黄山细纹新须螨的防治研究中发现，环链棒束孢对其有较高触杀效果[1];姚婷等在实验室条件下发现，环链棒束孢对线虫有强降解作用[4];罗力等验证出环链棒束孢在甘蓝蚜的防治上具有应用潜力[5];梁宗琦等发现，环链棒束孢对茶卷叶蛾和茶小卷叶蛾等茶树害虫等有直接触杀效果，并且致病率较高[6-7];张晓娜等所在的实验室研究证明，环链棒束孢对二斑叶螨也有很好的毒杀效果[8]。环链棒束孢在培养基的自然pH值时获得的产量最高，并且光照对环链棒束孢生长和产孢有促进作用[9-10]。由于虫生真菌具有环境友好和生物学相容的特点，并且符合害虫防治技术革命的要求，成为目前农林业所研究的重点内容[11]，也是许多国家目前都致力于生防研究的重点问题[12]。虫生真菌对动物和人均为非致病菌，不会对环境产生污染，无危害。它可以制成不同形式的药剂，像化学农药一样进行喷洒，简单快捷[13]。
　　由黄山学院生命与环境科学学院微生物实验室的李丰伯等制造出的一种太阳能杀虫器为一种全自动喷洒装置，使用时放置或悬挂在阳光直射地点，依靠太阳能电池板吸收光能提供动力，将一定量药剂置于仪器内并在操作面板设定喷洒时间、喷洒份量、每日喷洒次数与时间，由内部齿轮快速旋转喷出药剂，从而实现自动化喷洒释放。此杀虫器不适合粉剂以及粒径超过4 mm的药粉颗粒，适用于粒径为2 mm左右的药剂。本研究的目的是制作出一种适用于该装置的颗粒药剂。
　　缓释释放剂是一种根据环境条件、有害生物的危害特点和发生规律，采用农药药剂加工方法制作出试剂，使农药按照需要的释放剂量、固定的释放时间、稳定持续的释放速率而释放[14]，属于发展迅速的新兴领域[15]，其特点可概括为可控、高效、便捷、准确施药[16]。与传统剂型相比，缓释农药可减少降解[17]、淋溶[18]、蒸发等所带来的消耗，其制作方法通常包括喷雾干燥法、包埋法、界面聚合法、水相分离法等[19]。本研究采用操作较为简便快速的包埋法制作缓释颗粒。包埋法通常使用β-环糊精、壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、明胶等物质作为包埋材料，其中海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，因其具有低成本、无毒、可生物降解性、良好的生物相容性等特点在医药和农药缓释领域当中受到广泛关注[20-21]。本研究将虫生真菌与缓释剂结合，以环链棒束孢为杀虫物质，采用海藻酸钠为主要包埋材料制作出不同配比缓释剂，并对其进行性能分析比对，择优选出一种适用于太阳能杀虫器的缓释剂，从而改变向农田直接喷洒孢子粉模式，实现资源利用最大化，避免对资源以及人力所造成的浪费。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料
　　1.1.1 菌株 环链棒束孢，来自于贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，保存于黄山学院生命与环境科学学院微生物3113实验室。
　　于2017年8月至2018年2月在安徽省黄山市黄山学院生命与环境科学学院进行试验。
　　1.1.2 主要试剂 主要试剂详见表1。
　　1.2 培养基
　　查氏培养基（Cazpek）：NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCL 0.5 g，MgSO4 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然;将培养基 121 ℃ 下高压蒸汽灭菌30 min。
　　1.3 方法
　　1.3.1 不同浓度环链棒束孢缓释剂的制作 在 1 000 mL 三角烧瓶中配制：3%海藻酸钠/0.5%明胶/0.5%淀粉溶液1 000 mL，并高压蒸汽灭菌 121 ℃ 30 min。将环链棒束孢孢子粉过100目筛，待包埋剂冷却至室温后，按每10 mL混合0、0.5、1.0、1.5、2.0 g孢子粉，分5组，每组3个重复，充分混匀。将配制好的0.2 mol/L氯化钙溶液置于磁力搅拌器上的烧杯中，使用10 mL一次性无菌注射器（针头型号为4#）吸取每组混合液，调控磁力搅拌机转速400 r/min，匀速滴加到0.2 mol/L氯化钙溶液中，得到颗粒。包埋后的颗粒在室温下交联固化 24 h，弃去氯化钙溶液，使用无菌水清洗颗粒3次，放入35 ℃烘箱中干燥24 h，得到干燥缓释剂颗粒。
　　1.3.2 不同材料环链棒束孢缓释剂的制作 在 1 000 mL 三角烧瓶中配制：4%海藻酸钠溶液（缓释剂A）、2%海藻酸钠/2%明胶溶液（缓释剂B）、3%海藻酸钠/0.5%明胶/0.5%淀粉溶液（缓释剂C）各1 000 mL，按照每10 mL加1 g孢子粉的比例，使用 “1.3.1”節的方法制作环链棒束孢缓释剂，3个重复组。 　　1.3.3 缓释剂颗粒的成粒情况统计 收集并统计每10 mL各种混合溶液形成的缓释颗粒的颗粒数，并随机选取15颗缓释剂用电子显数卡尺测量并且计算其平均粒径。
　　1.3.4 缓释剂颗粒的机械强度检测 从交联固化好还没有烘干的环链棒束孢缓释剂中取出大小形状相当的小球4粒，在平坦的桌面上4个固定点摆成正方形，再在4个小球上面放1个培养皿，随后慢慢地往培养皿上加砝码，砝码质量由小递增，肉眼观察，直至小球产生形变，记录砝码质量，计算出小球所能承受的最大耐受力：每个小球承重=（培养皿的质量+砝码质量）/4。
　　1.3.5 缓释剂颗粒成球率统计 将每10 mL包埋剂与不同质量孢子粉的混合，制成成型缓释颗粒的总质量记作m总，10 mL包埋剂所用的包埋试剂质量记作m材，每10 mL加入的孢子粉质量记作mX，每组包埋剂与不同质量孢子粉的混合制成成型缓释颗粒的比率，记作成球率（granulation rate，GR）。
　　GR=m总/（m材+mX）。
　　1.3.6 缓释剂颗粒载药量统计 称取10 g环链棒束孢缓释剂，在研钵中充分研磨至粉末状，然后倒入盛有90 mL无菌水的三角烧瓶中加入玻璃珠振荡摇晃10 min左右，使缓释剂粉末与水充分混匀，采用稀释涂布法平板法，在查氏培养基上涂布，每组重复3次。在恒温培养箱中28 ℃下培养3～4 d，对每组1 g缓释剂中所含孢子数进行统计，所得结果为缓释剂颗粒的载药量。
　　1.3.7 缓释剂颗粒包埋率统计 包埋剂对孢子粉中孢子的利用率就是缓释剂颗粒的包埋率（embedding rate，记作ER），把1 g缓释剂的载药量记作D，10 mL原料成球总质量记作m总，每10 mL使用的的孢子粉质量记作mX，原材料1 g孢子粉中孢子数记作n，原材料中孢子粉中的孢子数检测方法同“1.3.6”节。
　　ER=（D×m总）/（n×mX）×100%。
　　1.3.8 缓释剂颗粒溶胀率统计 各取5 g干燥的缓释剂置于25 ℃的無菌水中，每隔0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、1 d和2 d时间取出所有缓释剂，滤纸吸干表面水分，称取t时的湿质量，按下式计算不同时间的溶胀率（swelling ratio，SR）。其中，md表示缓释剂干质量，mt表示缓释剂t时湿质量。
　　SR=（mt-md）/md×100%。
　　1.3.9 缓释剂颗粒释放速率统计 取各种缓释剂各5 g，放置于三角烧瓶中，倒入250 mL无菌水，三角烧瓶口用保鲜膜密封，室温下进行缓释释放试验，分别在1 h、2 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d和7 d吸取1 mL的溶液，采用稀释涂布法对缓释释放液中的孢子数进行检测，从而计算出各种缓释颗粒的缓释速率，每次吸取后补充等量的无菌水至三角烧瓶中密封瓶口。按下式计算不同时间不同缓释剂的释放速率，记作RE。
　　RE=NT/DL×100%。
　　式中：NT表示T时缓释剂释放出的环链棒束孢孢子量;DL为这种缓释剂原本的载药量。2 结果与分析
　　2.1 海藻酸钠/明胶/淀粉不同浓度环链棒束孢缓释剂性质分析
　　2.1.1 海藻酸钠/明胶/淀粉不同浓度环链棒束孢缓释剂成粒情况 从表2可以看出，随着孢子粉在缓释剂中的浓度增大，形成完整微球的数量呈现出先增大后减小的趋势，这可能是由于孢子粉比例影响到混合试剂的黏稠度，当孢子粉浓度从 0.15 g/mL 开始，成球颗粒减少，孢子粉浓度为 0.10 g/mL 的缓释剂颗粒成球率相对较高;微球粒径、微球的承重力随着孢子粉浓度的增加而增大，但是随着孢子粉浓度的增加，颗粒均匀度发生明显变化，成球难度加大，这是由于孢子粉浓度过高、试剂过稠造成针头堵塞，制作难度加大，从而影响海藻酸钠与氯化钙进行成膜反应。
　　 通过稀释涂布法测出原材料孢子粉的孢子含量为6.09×109 CFU/g，代入公式计算微球的载药量和包埋率。图1和图2描述了不同孢子粉浓度海藻酸钠/明胶/淀粉缓释剂载药量和包埋率，由图1和图2可以明显看出，随着孢子粉浓度加大，载药量也就越大，但是包埋率随孢子粉浓度增加而递减。在孢子粉浓度为0.05 g/mL时，微球包埋率表现较好。可能是由于芯材比例的加大，孢子粉更容易流失，包埋难度增加。一方面减小了海藻酸钠/明胶/淀粉对芯材的包埋能力，另一方面减小了微球的质量，使载药率升高。
　　2.1.2 海藻酸钠/明胶/淀粉不同浓度环链棒束孢缓释剂溶胀率分析 将固定时间点的每组微球称取的湿质量代入公式，得出t时的溶胀率。图3描述了海藻酸钠/明胶/淀粉不同浓度环链棒束孢缓释剂溶胀动力曲线，从图3可以明显看出空白微球溶胀率明显比加入了孢子粉微球的溶胀率高，加入了孢子粉的微球溶胀程度减半，这说明加入孢子粉对微球的溶胀率有明显的降低效果，但是加入的孢子浓度不同，对海藻酸钠/明胶/淀粉微球的溶胀率没有明显的影响。
　　2.1.3 海藻酸钠/明胶/淀粉不同浓度环链棒束孢缓释剂释放性能分析 对固定时间点取得的水样进行稀释涂布计数，并根据公式计算出每组缓释剂在相同时间内的释放率，得到图4海藻酸钠/明胶/淀粉不同浓度环链棒束孢缓释剂释放率。从图4中可以看出，海藻酸钠/明胶/淀粉微球释放率2 d内持续增长，在2 d后达到稳定水平。孢子粉浓度为0.05 g/mL的微球释放率相较于其他3组的效果差，释放率较低;0.10 g/mL孢子粉浓度的微球释放速率较为平稳。孢子粉浓度过高或过低时，缓释性能变差。孢子粉是通过微球溶蚀或降解释放扩散至外部环境，芯材比例较大的孢子粉更容易释放，但孢子粉浓度过高容易使微球崩解，导致缓释速率不稳定，并且释放程度也较差。
　　2.2 海藻酸钠/明胶/淀粉环链棒束孢缓释剂性质分析
　　2.2.1 海藻酸钠/明胶/淀粉环链棒束孢缓释剂成粒情况 使用等量的孢子粉制作出缓释剂A、B、C。从表3中可以明显看出，随着缓释剂中海藻酸钠所占比例的减小，小球成球数增加，小球粒径减小。相较下缓释剂B成球率较高，但缓释剂C所制作出的小球大小更均匀，承重效果也最好。 　　2.2.2 海藻酸钠/明胶/淀粉环链棒束孢缓释剂溶胀率分析 图7显示3种缓释剂的溶胀率依次表现为C>B>A，缓释剂A、B在12 h内达到最大溶胀率，缓释剂C在1 d内达到峰值，之后3种缓释剂溶胀率开始逐渐下降，可能是由于缓释剂产生溶蚀，缓释剂C的下降速度更快，是由于加入了易崩解的淀粉所导致的。
　　2.2.3 海藻酸钠/明胶/淀粉环链棒束孢缓释剂释药性能分析 从图8可以看出3种缓释剂在6 h前释放速率相当;6 h 后缓释剂A骤然上升，缓释剂B、C上升稳定，并且缓释剂C在2 d后所表现出的释放率比缓释剂A和B都高;在7 d后的释放率表现为C>B>A。这说明海藻酸钠中加入的明胶和淀粉这2种辅助材料对缓释剂的释放速率产生了一定的调控作用。
　　3 结论与讨论
　　本试验制作出了以海藻酸钠为主要原材料的环链棒束孢缓释剂颗粒，其直径在2 mm左右，当环链棒束孢孢子粉加入量为0.1 g/mL时，缓释剂颗粒的粒径约为1.86 mm，粒径较为均匀，与王梅等所制作的巨大芽孢杆菌包埋颗粒[22]相比较颗粒较小，更适用于太阳能杀虫器;成球率达到 96.85%，释放率平稳，在7 d后释放程度达到 66.99%;與宋双居等所制作出的明胶/海藻酸钠缓释微胶囊包埋率[23]相比较，3%海藻酸钠/0.5%明胶/0.5%淀粉环链棒束孢缓释剂对环链棒束孢孢子粉包埋率较高，当孢子粉添加量为0.5 g/mL时，包埋率最高，达98.42%。相对于包埋剂为4%海藻酸钠或2%海藻酸钠/2%明胶，3%海藻酸钠/0.5%明胶/0.5%淀粉作为包埋材料效果较好，此时小球承重力达到3.53 g，载药量增至4.08×109 CFU/g，包埋率增至93.78%，缓释速率趋于平稳。本研究仅对环链棒束孢缓释剂颗粒制作工艺进行设计与比对，并未对其进行野外杀虫试验，今后研究可以通过与太阳能杀虫器的结合进行大田试验，进一步探究其野外杀虫效果。
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