miR-33表达与炎症反应的关系

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　　摘要：目的  探讨miR-33表达与炎症反应的相关性。方法  细胞培养箱中培养人单核细胞（THP-1）48～72 h后传代，传至3代，加入100 ng/ml佛波醇（PMA）诱导24 h分化成为巨噬细胞。采用实时荧光定量PCR技术检测不同浓度LPS（0、1、10、100 ng/ml）以及10 ng/ml LPS不同刺激时间（0、24、36、48 h）THP-1巨噬细胞miR-33表达;另采用ELISA法检测THP-1巨噬细胞中TNF-α、IL-6和MCP-1表达量，分析miR-33表达与炎症反应的相关性。结果  随着LPS浓度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加，不同浓度组miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。随着LPS刺激时间（0、24、36 h）延长，miR-33表达逐渐上调、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加，36 h达到高峰，48 h逐渐下降到正常，不同时间点miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Pearson相关性分析显示，miR-33表达与TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相关（P<0.05）。结论  THP-1细胞中miR-33表达与其炎症反应具有一定正相关性。
　　关键词：内毒素脂多糖;微小RNA;炎症因子;单核细胞;脓毒症
　　中图分类号：R631;Q291                           文献标识码：A                                DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.02.020
　　文章編号：1006-1959（2020）02-0073-03
　　Abstract：Objective  To investigate the correlation between miR-33 expression and inflammatory response. Methods  Human mononuclear cells （THP-1） were cultured in a cell culture incubator for 48 to 72 h and then passaged to passage 3， and 100 ng / ml phorbol （PMA） was added to induce macrophage differentiation for 24 h.Detection of THP-1 macrophages miR-33 at different concentrations of LPS （0，1，10，100 ng/ml） and 10 ng/ml LPS at different stimulation times （0，24，36，48 h） using real-time PCR expression; ELISA was used to detect the expression of TNF-α， IL-6 and MCP-1 in THP-1 macrophages， and the correlation between miR-33 expression and inflammatory response was analyzed.Results  With the increase of LPS concentration （0，1，10，100 ng/ml）， the expression of miR-33， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels gradually increased. There were statistically significant differences in miR-33 expression， TNF-α， IL-6 and MCP- levels in different concentration groups（P<0.05）.With the extension of LPS stimulation time（0，24，36 h）， miR-33 expression gradually increased， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels gradually increased， peaked at 36 hours， and gradually decreased to normal at 48 h. There were statistically significant differences in miR-33 expression， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels at time points（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that miR-33 expression was positively correlated with TNF-α， IL-6 and MCP-1（P<0.05）.Conclusion  The expression of miR-33 in THP-1 cells has a positive correlation with its inflammatory response. 　　Key words：Endotoxin lipopolysaccharide;MicroRNA;Inflammatory factors;Monocytes;Sepsis
　　脓毒症（sepsis）是一种由细菌、病毒、真菌及寄生虫等各种病原微生物感染引起的全身性炎症反应，其本质是机体促炎性介质过度释放引起炎症反应失控，导致自身免疫性病理损伤，严重时可以发展为多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]。脓毒症临床治疗效果不佳、费用高昂，预后差，已成为重症监护室非心脏病患者死亡的主要原因。近年来基于脓毒症的病理生理，临床采用了单克隆抗体来中和TNF-α、IL-6和MCP-1等炎症因子新型生物疗法，但其治疗效果并不理想，因此有效预防、早期诊断及积极治疗脓毒症意义重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一种广泛分布于真核细胞内以及病毒中，长度约为20～24个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子[2，3]。有研究表明[4，5]，miR-33a可以调控人外周血单核巨噬细胞靶基因ABCA1的表达，参与机体脂质代谢，介导动脉粥样硬化形成。THP-1单核细胞在脓毒症的发生发展过程中起着关键作用，而目前miR-33与THP-1细胞炎症相关研究较少。本研究主要探讨miR-33与TNF-α、IL-6及MCP-1表达水平的相关性，旨在探讨其在脓毒血症进展中的意义，现报道如下。
　　1材料与方法
　　1.1细胞与试剂  研究时间：2019年2～3月。细胞：THP-1（中科院细胞生物所细胞中心）;脂多糖（LPS;Sigma，美国）;DMEM培养基、改良型RPMI-1640细胞培养基、Opti-MEM培养基（Gibco，美国）。试剂：TNF-α、MCP-1、IL-6 Human ELISA试剂盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。
　　1.2细胞培养及分组  细胞培养：THP-1细胞于改良型RPMI-1640细胞培养基中，37℃、5% CO2细胞培养箱中培养48～72 h后传代，传至3代，PI单染色法检测THP-1细胞存活率。將处于对数期THP-1单核细胞以密度为1×106/ml种植于6孔板中，每孔铺细胞悬液2 ml，并用100 ng/ml佛波酯（PMA）诱导24 h分化成贴壁的巨噬细胞。实验分组：①THP-1巨噬细胞随机分为4组，分别用不同浓度的LPS（0、1、10、100 ng/ml）诱导各组细胞24 h。②THP-1巨噬细胞随机分为4组，浓度为10 ng/ml LPS诱导各组细胞不同时间（0、24、36、48 h）。
　　1.3方法
　　1.3.1 miR-33表达  实时荧光定量PCR法检测miR-33表达：使用TRIzol法提取各组细胞沉淀中总RNA，紫外线分光光度定量，RNA/DNA微量分光光度计测定RNA纯度。按Invitrogen逆转录反应试剂盒说明进行RNA逆转录。cDNA合成过程采用miR-33s RT特异性构建逆转录体系，miR-33 RT引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACUUCACG-3';内参照U6 RT引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。miR-33 PCR扩增条件为：95℃，30 min;40个扩增循环（95℃ 8 s，64℃ 10 s，72℃ 20 s）。miR-33正向引物序列：5'-GGTTAGATCTTGCTCCAGCGGTTTG-3';反引物序列：5'-GTAAAGCTTGCCCTCCTGTTTCCTG-3'。内参照U6正向引物序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3';反向引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，相关引物序列均由上海吉玛制药技术有限公司提供。miR-33以U6为内参基因，相对定量用2-ΔΔCt计算，Ct值为目的基因达到设定阈值时的PCR循环次数，目的基因相对于内参基因的相对数△△Ct=（Ct靶基因-Ct内参）处理组-（Ct靶基因-Ct内参）未处理组。
　　1.3.2 TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平  收集各组细胞上清液，采用ELISA法检测TNF-α、IL-6和MCP-1含量，严格按照Human ELISA试剂盒内说明书进行试验操作。
　　1.4观察指标  比较不同浓度组（0、1、10、100 ng/ml）中miR-33表达及TNF-α、IL-6和MCP-1水平，不同时间组（0、24、36、48 h）中miR-33表达及TNF-α、IL-6和MCP-1水平，并分析miR-33与TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平的相关性。
　　1.5统计学方法  采用SPSS 23.0 软件进行数据分析处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验。采用Pearson相关分析miR-33与TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1不同浓度组中miR-33表达比较  随着LPS浓度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表达逐渐增加，不同浓度组中miR-33表达比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。
　　2.2不同浓度组中TNF-α、IL-6和MCP-水平比较  随着LPS浓度（0、1、10、100 ng/ml）增加，TNF-α、IL-6和MCP-1水平增加，不同浓度组中TNF-α、IL-6和MCP-水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.3不同时间组中miR-33表达比较  随着LPS刺激时间（0、24、36 h）延长，miR-33表达逐渐上调，36 h达到高峰，48 h逐渐下降到正常，不同时间组中miR-33表达比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。 　　2.4不同时间组中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较  随着LPS刺激时间（0、24、36 h）延长，TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加，36 h达到高峰，48 h下降到正常水平，不同时间组中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
　　2.5 miR-33与TNF-α、IL-6和MCP-1表达水平相关性分析  miR-33表达与TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相关（r=0.873、0.782、0.915，P<0.05）。
　　3讨论
　　脓毒症与全身过度炎症反应关系密切，免疫细胞激活、转录因子活化、炎症因子过度释放，进而启动炎症级联反应是其发生发展的重要病理机制[6]。大量炎症介质的释放是导致全身炎症反应综合征的“中心环节”，其中IL-6和TNF-α作为快速反应炎症因子，是启动“瀑布样反应”最上游的炎症介质，一定程度上反应了病情程度以及预后[7，8]。
　　miRNA根据碱基互补配对原则，通过与靶基因mRNA3'末端非翻译区特异性结合降解或抑制其翻译，在转录后水平调控靶基因表达。研究表明[9]，在脓毒血症发生发展的过程中，多种miRNA（miRNA-346、miRNA-147、miRNA-142-3p、miRNA-155、miRNA-9）参与了致炎基因表达的调控，从而影响炎症细胞的增殖分化以及炎症因子的产生释放。本研究结果表明，随着LPS浓度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加，不同浓度组中miR-33表达、中TNF-α、IL-6和MCP-水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明LPS能够诱导THP-1细胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表达，并呈现浓度依赖性。随着LPS刺激时间（0、24、36 h）延长，miR-33表达逐渐上调、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐渐增加表达逐渐上调，36 h达到高峰，48 h逐渐下降到正常，不同时间组中miR-33表达、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明LPS能够促进THP-1细胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表达，并具有时间依赖性。Pearson相关分析显示，miR-33表达与TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相关（P<0.05），说明miR-33可能参与调节THP-1细胞TNF-α、IL-6和MCP-1的表达。
　　综上所述，miR-33可能参与了THP-1细胞炎症反应调控，其具体机制还有待一步研究。
　　参考文献：
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　　收稿日期：2019-11-20;修回日期：2019-11-28
　　編辑/杜帆
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