补肾化浊方联合粪菌移植对来曲唑诱导的多囊卵巢综合征大鼠生殖、代谢功能及相关炎症因子的影响

来源:用户上传      作者:肖慧 刘艳霞 仰艳 邢雅雯 易莎 征征 邢玉

　　摘要：目的  以肠道微生态为切入点探讨补肾化浊方联合粪菌移植治疗多囊卵巢综合征（PCOS）潜在机制。方法  将30只6周龄SD大鼠随机分为空白组、模型组、中药组、粪菌移植组、中药+粪菌移植组，每组6只。来曲唑1 mg/（kg·d）灌胃51 d，第22日起，中药组加灌补肾化浊方21.7 g/（kg·d），粪菌移植组加灌新鲜粪便2 g/（kg·d），中药+粪菌移植组加灌补肾化浊方21.7 g/（kg·d）和新鮮粪便2 g/（kg·d），连续30 d，另设空白组。干预结束后，腹主动脉取血检测大鼠血清性激素、空腹胰岛素（FINS）、空腹血糖（FPG），ELISA检测大鼠血清白细胞介素（IL）-18、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，HE染色观察大鼠卵巢形态学变化。结果  与空白组比较，模型组大鼠卵巢呈多囊样改变，体质量、睾酮、黄体生成素（LH）/促卵泡激素（FSH）、FPG、HOMA-IR、IL-18、TNF-α水平均明显升高（P<0.01，P<0.001）;与模型组比较，中药+粪菌移植组可显著改善上述指标（P<0.05，P<0.01，P<0.001），中药组可显著改善除TNF-α外各项指标（P<0.05，P<0.01），粪菌移植组可显著降低PCOS大鼠LH/FSH、IL-18水平（P<0.01，P<0.001）;在降低IL-18水平方面，中药+粪菌移植组作用显著优于中药组（P<0.01）。结论  中药联合粪菌移植可显著改善PCOS大鼠生殖和代谢功能，改善慢性炎症状态。
　　关键词：多囊卵巢综合征;粪菌移植;补肾化浊方;胰岛素抵抗;大鼠
　　中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2020）02-0033-05
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201908213
　　Effects of Bushen Huazhuo Prescription Combined with Fecal Microbiota Transplantation
　　on Polycystic Ovary Syndrome Induced by Letrozole in Rats
　　XIAO Hui1， LIU Yanxia2， YANG Yan2， XING Yawen1， YI Sha1， ZHENG Zheng1， XING Yu2
　　1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China;
　　2. Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China
　　Abstract： Objective To investigate the potential mechanism of Bushen Huazhuo Prescription （BSHZ） combined with fecal microbiota transplantation （FMT） in polycystic ovary syndrome （PCOS） induced by letrozole in rats by taking intestinal micro-ecology as an entry point. Methods Thirty six-week old SD rats were divided into control group， model group， TCM group， FMT group and TCM combined with microbiota transplantation （TCM+FMT） group， with 6 rats in each group. Rats were treated with letrozole by gavage for 51 days. From the 22nd day， TCM group was treated with BSHZ [21.7 g/（kg·d）] for 30 days， FMT group was treated with fresh fecal [2 g/（kg·d）] for 30 days， and TCM+FMT group was treated with both BSHZ [21.7 g/（kg·d）] and fresh fecal [2 g/（kg·d）] for 30 days. The control group was established. After the treatment， abdominal aortic blood was taken to detect the levels of serum sex hormone， fasting insulin （FINS）， fasting plasma glucose （FPG）. The levels of serum IL-18 and TNF-α were detected by ELISA. The ovary tissue was observed by HE staining. Results Compared with control group， there were more cyst-like follicles in ovary tissue， and the weight， the testosterone， luteinizing hormone （LH）/follicle stimulating hormone （FSH）， FPG， HOMA-IR IL-18， and TNF-α all increased in model group （P<0.01， P<0.001）; Compared with model group， all indexes above in TCM+FMT group increased （P<0.05， P<0.01， P<0.001）， and TCM group improved almost all indexes above except for TNF-α （P<0.05， P<0.01）. FMT group could significantly decrease LH/FSH andthe level of serum IL-18 （P<0.01， P<0.001）. TCM+FMT group was better than TCM group in decreasing the levels of IL-18 （P<0.01）. Conclusion TCM combined with fecal microbiota transplantation can significantly improve the reproductive function， metabolism， and chronic inflammatory state of PCOS rats. 　　Keywords： polycystic ovary syndrome; fecal microbiota transplantation; Bushen Huazhuo Prescription; insulin resistance; rats
　　多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是最常見的影响育龄期女性生殖内分泌疾病，其发病率约占8%～13%[1]。PCOS可引起约80%排卵障碍性不孕[2]，使患妊娠糖尿病、子痫前期、复发性流产等妊娠相关疾病[3]，以及抑郁症、抑郁症、卒中、子宫内膜癌等患病风险增加，严重危及女性健康。国外最新研究表明，肠道菌群在PCOS的发病中起重要作用[4]。中医药治疗PCOS疗效确切[5]，但机制尚不明确。补肾化浊方是治疗PCOS的经验方，粪菌移植是研究肠道菌群与疾病相关性的重要方法。本实验复制来曲唑诱导的大鼠模型，以补肾化浊方联合粪菌移植进行干预，研究中药联合粪菌移植对PCOS大鼠体质量、卵巢形态、性激素、血糖、炎症因子等水平的影响，探讨中药联合粪菌移植治疗PCOS的潜在机制。
　　1  材料与方法
　　1.1  动物
　　雌性SD大鼠30只，SPF级，6周龄，体质量（200±10）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。常规饲养于北京中医药大学SPF级屏障环境，12 h光照/黑夜循环，温度25 ℃，湿度60%，自由摄食饮水。
　　1.2  药物
　　补肾化浊方（菟丝子15 g，枸杞子15 g，清半夏8 g，当归15 g，茯苓15 g，丹参20 g，制香附10 g，川芎10 g，白芍15 g，甘草6 g，青皮6 g，薏苡仁20 g，车前子10 g，桔梗10 g，败酱草20 g，冬瓜皮30 g），饮片购自北京中医药大学东方医院，常规煎制，制成含5.35 g原药材/mL;来曲唑片，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号190316KG。
　　1.3  主要试剂与仪器
　　黄体生成素（LH）测定试剂盒（北京北方生物技术研究所，批号20190512），促卵泡激素（FSH）测定试剂盒（北京北方生物技术研究所，批号20190516），血清睾酮（T）测定试剂盒（北京北方生物技术研究所，批号20190602），白细胞介素-18（IL-18）酶联免疫试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20190404），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号20190410），血糖酶法试剂盒（北京百奥泰康生物技术有限公司，批号DL201901），胰岛素放射免疫法试剂盒（北京北方生物技术研究所，批号20190503）。离心机（恒诺仪器，AXTGL16M），切片机（Leica，RM2235），石蜡包埋机（Leica G1150H），全自动生化仪（日本奥林巴斯株式会社，AU480），γ放射免疫计数器（西安核仪器厂，XH-6080），全自动酶标仪（THERMO V.2.3）。
　　1.4  分组、造模和给药
　　采用随机数字表法将30只大鼠随机分为空白组、模型组、中药组、粪菌移植组、中药+粪菌移植组，每组6只。适应性喂养1周，将来曲唑1 mg/（kg·d）溶于1%羧甲基纤维素（CMC）中，除空白组外，其余各组大鼠连续灌服21 d，复制PCOS大鼠模型[6]。空白组大鼠同期灌服等体积等浓度基质CMC，第22日起，除空白组灌服CMC外，其余各组继续灌服来曲唑药液1 mg/（kg·d），中药组加灌补肾化浊方药液21.7 g/（kg·d）[7]，粪菌移植组加灌空白组新鲜粪便（收集4 g空白组新鲜粪便，于20 mL生理盐水中混匀，3 min后灌服[8]）2 g/（kg·d），中药+粪菌移植组加灌补肾化浊方药液21.7 g/（kg·d）和空白组新鲜粪便2 g/（kg·d）。每日1次，连续30 d。
　　1.5  取材
　　最后1次给药后，大鼠饥饿12 h，腹腔注射0.4%戊巴比妥（l mL/100 g）麻醉，75%酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔，腹主动脉取血，取大鼠卵巢，4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片，HE染色，镜下观察。
　　1.6  血清学检测
　　大鼠腹主动脉取血4 mL，1500 r/min离心5 min，取血清，放射免疫法检测血清T、FSH、LH、空腹胰岛素（FINS），酶法检测空腹血糖（FPG），计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR，FPG×FINS÷22.5），ELISA检测血清IL-18、TNF-α水平。
　　1.7  统计学方法
　　采用SPSS22.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示。多组比较符合正态分布且方差齐用ANOVA检验，若P<0.05采用LSD进行两两比较;如数据不符合正态分布或方差不齐则采用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2  结果
　　2.1  中药联合粪菌移植对大鼠体质量的影响
　　中药组和中药+粪菌移植组各1只大鼠在实验第35、28日因灌胃操作不当于10 min内死亡。与空白组比较，模型组大鼠体质量显著升高，差异有统计学意义（P<0.001）;与模型组比较，中药组和中药+粪菌移植组大鼠体质量显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），粪菌移植组大鼠体质量与模型组比较无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
　　2.2  中药联合粪菌移植对大鼠性激素水平的影响
　　与空白组比较，模型组大鼠LH/FSH、T水平显著升高，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.001）;与模型组比较，中药组、粪菌移植组和中药+粪菌移植组LH/FSH、T水平显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表2。 　　2.3  中药联合粪菌移植对大鼠卵巢组织形态的影响
　　空白组大鼠可见优势卵泡和黄体;模型组大鼠无优势卵泡，有较多小卵泡;中药组、粪菌移植组、中药+粪菌移植组大鼠小卵泡较模型组明显减少，且可见排卵后黄体或较大卵泡。见图1。
　　2.4  中药联合粪菌移植对大鼠空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响
　　与空白组比较，模型组大鼠空腹血糖、HOMA-IR水平显著升高（P<0.001，P<0.01）;与模型组比较，中药组、中药+粪菌移植组FPG、HOMA-IR水平显著降低（P<0.01，P<0.05）。结果见表3。
　　2.5  中药联合粪菌移植对大鼠血清白细胞介素-18、肿瘤坏死因子-α水平的影响
　　与空白组比较，模型组大鼠IL-18、TNF-α水平显著升高（P<0.001）;与模型组比较，中药组、粪菌移植组、粪菌移植+中药组大鼠IL-18水平均显著降低（P<0.05，P<0.001），中药+粪菌移植组大鼠TNF-α水平显著降低（P<0.01）;与中药组比较，中药+粪菌移植组大鼠IL-18水平显著降低（P<0.01）。结果见表4。
　　3  讨论
　　人类肠道中有超过100万亿个微生物，被称为“成人的第二大脑”，肠道菌群基因又被看作“人类第二基因组”[9]。研究表明，PCOS患者与正常女性比较，肠道菌群α多样性降低[10-11]。最新研究表明，分别以PCOS和正常者粪便给予小鼠灌胃，结果发现，移植PCOS菌群小鼠表现出胰岛素抵抗、动情周期紊乱、生育力下降、卵巢组织中小卵泡增多和黄体减少，而移植正常人群肠道菌群小鼠并无上述表现，提示肠道菌群与PCOS表现密切相关[4]。中西医结合治疗PCOS优势突出。本研究所用补肾化浊方为刘艳霞教授治疗PCOS经验方。本病病机为本虚标实，虚主要为肾虚，实为痰、湿、瘀互结，吴鞠通谓“湿久浊凝”，痰浊下注，凝聚冲任、胞宫。治宜补肾活血、燥痰化浊。补肾化浊方由五子衍宗丸、四物汤、二陈汤、薏苡附子败酱散、芍药甘草汤合方加减化裁而成。方中菟丝子、枸杞子补肾填精，共为君药，以治本。当归活血补血，清半夏燥湿化痰，以治标;茯苓健脾利湿，既以后天补先天，助君药以固本，又利湿以治标。上3味共为臣药。川芎、白芍、丹参，佐助当归以活血祛瘀;青皮、制香附相伍疏肝理气行滞，既佐助半夏以消痰，又可行气以活血;车前子、薏苡仁、冬瓜皮，佐助茯苓以利湿通淋;桔梗祛痰利气，败酱草清热祛痰、活血祛瘀。上10味共為佐药。甘草与芍药共用，酸甘化阴，佐助当归以补阴血，又可调和诸药，为佐使药。诸药共奏补肾活血、燥痰化浊之效。此方肝、脾、肾三脏同调，以达标本兼治之功。
　　本实验采用中药联合粪菌移植方法研究二者联合治疗PCOS的作用机制，结果表明，PCOS大鼠雄激素水平升高，卵巢组织HE染色示卵巢呈多卵泡改变，表明PCOS大鼠模型成功建立。模型组大鼠体质量、LH/FSH、FPG、HOMA-IR、IL-18、TNF-α水平等均升高，均与PCOS临床表现一致。中药组大鼠体质量、T、LH/FSH、卵巢内小卵泡数量、FPG、HOMA-IR和IL-18水平等均降低，表明中药可改善PCOS大鼠生殖功能，改善内分泌紊乱、糖代谢紊乱和慢性炎症状态。粪菌移植组PCOS大鼠体质量、小卵泡数量、LH/FSH、IL-18水平均下降，表明单纯粪菌移植可调节PCOS大鼠内分泌，降低炎症因子水平，但作用有限。中药+粪菌移植组可显著改善大鼠生殖和代谢功能，改善慢性炎症状态，其整体改善作用优于中药组和菌群移植组。
　　有研究表明，PCOS模型大鼠给予益生菌治疗后，肠道菌群多样性恢复，并改善生殖和代谢功能[12]。此结果与本实验结果一致。提示改善肠道菌群后，PCOS症状好转，为从肠道菌群入手治疗PCOS提供了新的研究思路。PCOS患者血清中C反应蛋白、TNF-α、IL-18、IL-6等炎性介质水平升高，提示PCOS存在亚临床慢性炎症[13]。且结果表明，PCOS大鼠卵巢局部炎症因子TNF-α、IL-18水平较空白组均升高，而升高的TNF-α、IL-18、IL-6均可通过调控胰岛素相关信号通路，降低胰岛素敏感性，引起胰岛素累积，如升高的TNF-α可减少胰岛素受体底物1的酪氨酸磷酸化，抑制胰岛素信号转导;促进脂肪分解，增加游离脂肪酸，间接影响胰岛素敏感性;下调脂肪细胞中多种重要的信号分子或蛋白表达，导致胰岛素累积[14-15]。增多的胰岛素进一步导致卵巢产生更多的雄激素，干扰正常卵泡的发育，促进卵泡闭锁，从而加剧PCOS。中药可改善肠道菌群的组成，从而减轻菌群失调和由此导致的病理现象，如增加益生菌的丰富度，三萜类化合物如人参皂苷、甘草苷、桔梗皂苷等，黄酮类化合物如槲皮苷、黄芩苷等，环烯醚萜类化合物如当归苷、芍药苷等均可增加拟杆菌和双歧杆菌的丰度[11]。本实验结果表明，中药+粪菌移植组在改善慢性炎症状态方面的作用显著优于中药组和粪菌移植组。提示联合疗法可能是通过中药和肠道菌群的协同作用，改善肠道微生态，降低炎症因子水平，进而缓解胰岛素抵抗、降低T水平，抑制卵泡闭锁，从而起到治疗PCOS的作用。
　　本实验采用来曲唑造模方法，来曲唑干预总时间为51 d，模型组大鼠FPG水平显著升高，但FINS水平未升高，可能与来曲唑干预时间过短有关。本实验模型组HOMA-IR显著升高，说明模型组存在胰岛素抵抗的表现。在今后实验中可通过糖耐量试验、胰岛素耐量试验等多种方法，全方位判断是否存在胰岛素抵抗的现象。
　　综上，本实验采用补肾化浊方联合粪菌移植的方法干预PCOS大鼠，初步探讨中药联合粪菌移植对PCOS大鼠的影响及潜在机制。结果表明，中药+粪菌移植组可显著改善大鼠生殖和代谢功能，改善慢性炎症状态，其整体改善作用优于中药组和菌群移植组。联合疗法的治疗作用可能是通过中药和肠道菌群的协同作用，改善PCOS肠道微生态，降低炎症因子水平实现的。本研究为防治PCOS提供了新思路，可为从肠道菌群入手，以代谢-免疫-内分泌稳态中的关键分子为靶点，深入探讨补肾化浊方治疗PCOS的机制奠定基础。 　　参考文献：
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　　（收稿日期：2019-08-14）
　　（修回日期：2019-09-05;編辑：华强）
　　基金项目：国家自然科学基金青年基金（81904241）;北京中医药大学青年教师项目（2018-JYBZZ-JS099）
　　通讯作者：邢玉，E-mail：xingyu465@126.com
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