茶树组织培养常见问题研究进展

来源:用户上传      作者:李解　唐敏　翟秀明　侯渝嘉

　　摘   要   与其他植物组织培养的快速发展相比，茶树组织培养至今仍未建立完善的高频再生体系，究其原因，主要是茶树组织培养过程中常会出现褐变、黄化、玻璃苗、畸形、污染等问题。基于此，综述了目前茶树组织培养中的常见问题及其防治措施，并展望了茶树组培的发展潜力。
　　关键词   茶树;组织培养;褐化;超度含水态
　　中图分类号：S571.1    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.7.014
　　在茶树种质资源保存、新品种选育及种性改良等方面，茶树组培技术具有打破种属界限、克服远缘杂交不亲和等问题的优势。茶树组培技术从最初的以幼茎材料研究离体咖啡碱的合成[1]，到以茶树子叶、花药为材料诱导分化获得再生植株[2-3]，再到目前以不同器官为外植体获得植株[4-7]，其技术取得了显著提高。茶树为多年生木本植物，生长速度慢，增殖率、成苗率较低，在组培工作中常会出现褐变、黄化、玻璃苗、畸形胚、污染等问题，这既影响组培实验结果，甚至导致实验失败，也阻碍了组培快繁技术的应用。为此，本文就目前茶树组织培养应用过程中的常见问题及其防治措施进行综述，旨在为茶树组培技术优化、茶树新品种选育及种质资源保存等方面的研究提供参考。
　　1 茶树组培中的褐化问题
　　1.1 外植体的选择与切割方式
　　茶树为木本植物，其植物体内多酚类物质含量较高，外界物理损伤破碎细胞后，酚类物质开始发生氧化作用，导致茶树外植体在组培过程中褐化现象显著。因此，茶树外植体的选择与切割方式会直接影响外植体褐化程度。有研究表明，茶树外植体褐化程度一般随着材料的嫩度、组织木质化程度的提高及外植体受伤害程度的增加而加深。黄皓等[8]在诱导茶树愈伤组织选择外植体研究中发现，随着材料嫩度的降低（茶树茎段→叶片→种子），外植体褐化程度降低而诱导率增高。黄燕芬等[9]在3种横切方式对外植体褐变和腋芽萌动生长影响研究表明，腋芽叶片横切后保留2/5与保留1/2、保留整个带腋芽叶片相比，腋芽萌动生长状况最好，褐化程度居中。张志兰[10]研究发现，经过消毒的山茶花茎段外植体剪去一段茎段接入培养基，会一定程度上降低褐化现象，表明尽量缩短外植体伤口与氧的接触时间能够较大程度地减少褐化危害。
　　1.2 培养基和培养条件
　　植物的基础培养基种类较多，如MS、N6等，因各类培养基内所含成分不同，其组培褐变程度影响也有差异。目前茶树组培中最常见的培养基为MS培养基，具有无机盐含量高、微量元素丰富等特点;但有研究者通过提高培养基内无机盐含量实验发现，伴随无机盐浓度的增加，多酚类物质的产生加快，外植体褐变程度加重[11]。成浩等[12]在研究大量元素对于茎段生长影响的研究中发现，培养基大量元素减半能够很好的降低茎段的褐变程度，同时也促进了茎段的诱导和生长。赵玮[13]就铁盐浓度对于茶树组培中茶树茎段与愈伤组织的影响研究结果表明：培养基内铁盐浓度的加大，二者褐化程度都逐渐增高，其中以对照组与0.25倍铁盐浓度褐变程度较低，而以生长表现来说，0.5倍铁盐在茶树组培过程中表现最好。
　　1.3 消毒时间及方式
　　目前，植物组培过程中灭菌剂与消毒方式的选择较多，茶树组培中常用的灭菌剂为酒精、升汞、次氯酸钠等，通常选择70%～75%酒精和0.1%～0.2%升汞进行外植体消毒。有研究表明，通过加长外植体消毒时间，能都达到更好的消毒效果，但褐变程度会加重[14];因此，在茶树组培过程中能够将污染率和褐化率都降低到低水平比较困难，同时证明，通过控制消毒时间来降低外植体褐变程度的操作较为困难。也有研究认为，外植体消毒后清洗不彻底是导致其褐变程度严重的原因之一，姚永宏[15]在研究不同灭菌方式对褐化程度的影响研究中发现，通过对比不同的灭菌方式其褐变程度差异不显著，但在清洗方式上，磁力揽拌清洗方式的褐变程度显著低于手摇和静止的清洗方式。
　　1.4 植物生长调节剂
　　植物组培中常用的生长调节剂主要包括生长素类（2，4-D、IBA等）、细胞分裂素（6-BA、KT等）、脱落酸（ABA）、GA3等。阙生全等[16]在生长素类调节剂对于外植体诱导生长及褐化影响的试验中发现，高浓度的2，4-D会刺激外植体褐化时间提早，褐化率增高，褐变程度加深，导致外植体死亡，同时也会降低愈伤组织的诱导率。黄燕芬等[9]研究发现，不同浓度6-BA对于外植体褐变程度影响不同，在高浓度6-BA条件下的外植体褐化率极显著高于低浓度，同时发现低浓度条件下的6-BA不仅褐变反应慢，更适宜外植体茎尖的分化生长。此外，秦廷豪等[17]研究发现通过含不同浓度生长调节剂的培养基交替培养可降低继代培养中的多酚危害。
　　1.5 抗氧化剂和吸附剂的应用
　　植物组培过程中不同抗氧化剂和吸附剂的使用也不同程度地影响外植体褐化。目前，茶树组培中常见的抗氧化剂和吸附剂有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）、抗坏血酸（VC）等。张亚萍等[18]通过对比浸泡与没有浸泡过VC的茎段、芽尖的褐变程度发现，浸泡过VC的茎段、芽尖的褐化程度都明显降低。阙生全等在研究各种配比抗氧化剂和吸附剂培养基对于外植体褐化影响实验中发现，在控制褐变效果上，以添加吸附剂（AC和PVP）的控制效果最好，在添加抗氧化剂的培养基中表现为褐变程度较为严重，其中以添加Na2S2O3最为严重。然而就外植体愈伤组织生长势来看，添加VC的培养基要优于添加吸附剂的培养基。因此，在培养基中添加少量适宜浓度的抗氧化剂和吸附剂，可以在控制褐变反应的同时促进外植体生长。
　　2 茶树组培中的黃化、畸形问题
　　2.1 培养基中矿物质营养不均衡
　　培养基中矿物质营养不均衡、生长调节剂配比不当、瓶内乙稀等次生代谢物含量增高、光照不足、温度不适等因素都可能导致茶树组培苗黄化、畸形现象的产生。有研究表明，N、S、Mg、Fe、Mn、Cu、B、Zn是植物生长所必需的营养元素，植物正常生长发育过程中，当某一种元素缺失表现为不足时，其他元素会因最低因子律的制约导致其含量再多也无法发挥作用，植物本身出现失绿症[19]。主要表现为：N缺乏，叶色变淡，乃至黄色，植株矮小，瘦弱;S缺乏，新叶失绿黄化;Mg缺乏，中下部叶脉间失绿黄化;缺Mn，茶树叶片发黄，严重时出现褐斑、干枯脱落;缺B、Zn，节间缩短，叶片失绿畸变，有簇生现象，生长缓慢;缺Cu，叶片细胞失去膨压呈萎凋状态，叶薄色浅，严重时全株大量落叶;缺Fe，顶芽淡黄，嫩叶花白色，严重时叶片呈白色、枯死[20]。姚元涛等[21]在山东棕壤茶园幼龄茶树叶片黄化病因诊断与防治的研究中发现，Mn、Cu、Zn在茶树叶片叶绿素形成过程中表现为某些酶的活化剂，是叶片中叶绿素含量高低和叶绿体结构完整性的重要调节元素。黄萍等[22]在4种因子对于马铃薯茎尖培养黄化影响的研究中发现，Mg、N、Fe在适宜浓度条件下都具有显著抑制黄化苗发生的作用，但浓度过高或过低的Mg和N会导致黄化率的增高，而在高浓度下Fe盐会显著降低黄化苗的发生。 　　2.2 生长调节剂配比不当
　　生长调节剂是组织培养中非常关键的一类成分，需要根据培养目标给予适合的配比，过高或过低均会影响组培苗的生长。史俊等[23]研究表明，在低生长调节剂水平下，碧云茶树组培苗生长势较好、叶色深绿，但随着生长调节剂浓度的提高，组培苗叶片开始发黄、生长势变弱，严重时出现死亡。黄华艳等[24]研究表明，通过交替使用不同高低浓度的细胞分裂素和生长素，组培苗的生长效果更显著。而张文珠等[25]在丽格海棠的组织培养实验中也发现，交替使用最适培养基与无生长调节剂MS培养基相较于一直使用同一种培养进行继代培养，组培苗生长势更好。
　　2.3 乙烯等次生代谢物含量增高
　　乙烯是培养物在密闭环境中进行生理代谢活动时产生与积累，对植物组织的影响有利有弊，其负面影响包括抑制芽的分化、阻碍植物成长和促进老化[26]。华智锐等[27]在研究不同浓度活性炭与黄芩组培苗黄化现象的关系实验中发现，通过在培养基加入活性炭能够显著降低黄芩组培苗黄化率，二者呈负相关关系，当培养基中活性炭含量由0.5 g·L-1提高到1g·L-1时，黄芩组培黄化率降低幅度最大，为30%下降到9%。研究者认为活性炭作为吸附剂，能够有效地吸附黄芩组培苗生长过程中产生的乙烯等代谢产物，从而平衡培养基中各种生长调节剂，稳定pH值，保障了组培苗的正常生长。
　　2.4 类菌原体
　　植原体，原称类菌原体，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，专性寄生于植物的韧皮部筛管系统[28]，可引起植物病害，如枝叶簇生成团，似茶树缺锌症状，黄化，新生叶细小硬化，节间缩短，花器变态，生长衰退甚至枯死等，且筛管内往往有多量愈伤组织增生[29]。与黄化病有关的植原体最早在美国翠菊植株上发现的[30]。在茶树上，植物菌原体黄化病害于早年在云南省保山茶区发现[31]。目前，对于该病害的防治，还未发现经济、高效、环保的药物。
　　3 超度含水态
　　植物组织培养过程中，组培苗会出现矮小膨胀失去绿色、新梢或叶片表现为透明或半透明状、叶片质脆而卷曲的生长异常现象，这种试管苗生长异常现象为组培苗“玻璃化”，于1981年Debergh首次命名[32]，1990年改用“超度含水态”。该现象是植物组培过程中的一种特有的生理失调或生理病变，由培养条件中的多种因素相互作用导致组培苗细胞内新陈代谢紊乱所致。这些生长异常的组培苗，一般光合能力与酶活性都较低，器官功能不全，组织畸形，难以增殖分化、生根成苗，通常不会选择作为继代培养和扩繁的材料[33]。
　　玻璃苗的发生与培养基中的琼脂和蔗糖浓度偏低、离子种类或浓度不当、以及培养温湿度和光照等有关。张燕玲等[34]在丝石竹的玻璃化现象实验中发现，一定浓度条件下，丝石竹组培苗的玻璃化率与蔗糖含量呈负相关，培养基中蔗糖含量的增加会降低丝石竹组培苗玻璃化的发生。而龚明霞等[35]也在洋桔梗玻璃化苗的研究中发现，通过在培养基中加入适宜浓度的蔗糖能够促进洋桔梗组培苗玻璃化性状的恢复。因此，为降低植物组培中玻璃化苗的产生，可从外植体选择和培养基选择，增加琼脂、蔗糖用量及Zn2+、Ca2+等离子浓度等方面着手。
　　4 展望
　　茶树组培在茶树种质资源保存、新品种的选育及种性改良等研究方面具有重要作用。今后茶树组培的研究工作，需要加强各类生长调节剂的调控作用研究，完善对珍稀茶树资源的离体保存，丰富茶树种质资源，重点研究开发茶树组培与转基因技术相结合的新方法，设计建立更优的茶树组培苗转化体系技术，实现目标基因的转移，最终培育出具有特、异、优性状的茶树新品种。
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　　（责任编辑：敬廷桃）
　　收稿日期：2019-11-30
　　作者简介：李解（1991—），男，重庆垫江人，硕士，研究实习员，主要从事茶树育种。※为通信作者，E-mail： 617393574@qq.com。
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