百日菊白粉菌的分子检测与鉴定

来源:用户上传      作者:刘闰 周暄 邢帅

　　 摘要：对百日上的白粉菌进行分子生物学分析，采用试剂盒法提取病原菌总基因组DNA，PCR扩增其rDNA内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）的保守序列并测序，并通过Clustal与MEAG软件构建系统发育树推演系统进化关系，在分子水平鉴定该菌种并比较与其他白粉菌菌种的亲缘关系。结果表明，本研究测序的百日菊白粉菌BC180623的ITS序列与发生在土耳其菊芋上的Erysiphe cichoracearum（KF453969.1）相似度达到99%，与其具有比较近的亲缘关系。以百日菊白粉菌为研究对象，在分子水平鉴定该菌种并分析其进化亲缘关系为本试验的创新之处。
　　 关键词：百日菊;白粉菌;内转录间隔区;序列分析
　　 中图分类号：S435.672  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）06-0098-06
　　百日菊（Zinnia elegans Jacq.）别称百日草，为中药材，以全草入药。百日菊也是一年生草花主栽品种之一，其色彩丰富，花大、艳丽，花期长达百日，故得百日菊之美名。白粉病是百日菊常见的最重要病害之一，在生长区几乎每年都普遍发生[1-3]。百日菊被白粉菌侵染后，最初叶片出现白色粉状斑点，后病斑扩大或相连成片，发病后期叶面布满白色粉层，叶片变褐，严重影响观赏价值，甚至导致植株成片死亡。发病后期在发病部位形成的小黑点即为病菌的闭囊壳。据以前的研究报道有2个属的白粉菌引起百日菊的白粉病，分别是白粉菌属（Erysiphe）和单丝壳属（Sphaerotheca），属于子囊菌门（Ascomycota）白粉菌目（Erysiphales），白粉菌科（Erysiphaceae）[4-7]。
　　 白粉菌传统的鉴定以其形态学为主要特征，如有性世代闭囊壳内子囊的个数及子囊孢子的数目，闭囊壳外附属丝的特征等，但传统的分类特征有诸多不足之处[8-11]。近年来，分子生物学在植物病害鉴定上的应用越来越广泛，特别是植物病原菌在rDNA的内转录间隔区（internal transcribed spacer，简称ITS）既具有保守性，又在科、属、种水平上均有特异性序列的特点，通过特异性引物对ITS区段进行PCR扩增，可用于快速鉴定、检测植物病原菌以及病害的诊断等[12-13]。目前国内关于百日菊白粉病病原菌分子分类系统的研究未见报道，通过提取百日菊白粉菌总基因组DNA，利用分子生物学技术对其分类特征及进化关系进行研究，可为该花卉白粉病的准确调查提供有效和实用的手段。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　 白粉菌样本于2017年8月12日采自黑龙江省哈尔滨市东北林业大学城市实验林场，样品编号为BC180623，寄主植物为百日菊。提取白粉菌基因组DNA的试剂盒购自盛泽生物试剂有限公司（目录号：DP321）。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 样品白粉菌的收集 刀片轻轻刮下叶片表面的菌丝与闭囊壳混合物，放入2 mL离心管中，置于-4 ℃冰箱中保存。
　　1.2.2 基因组DNA的提取 采用试剂盒法提取百日菊白粉菌基因组DNA：（1）取适量白粉菌菌丝放入研钵中，加入液氮充分研磨;（2）加入400 μL缓冲液FP1和6 μLRNaseA（10 mg/mL），涡旋振荡 1 min，室温放置10 min;（3）加入130 μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min，12 000 r/min离心 5 min，将上清液转移至新的离心管中，重复这一步骤;（4）向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时出现絮状基因组DNA，离心2 min，弃上清，保留沉淀;（5）加入700 μL 70%乙醇，涡旋振荡5 s，12 000 r/min离心2 min，弃上清，重复这一步骤;（6）开盖倒置，室温晾干10 min，彻底晾干残余的乙醇;（7）加入适量洗脱缓冲液TE，65 ℃水浴 10～60 min溶解DNA，期间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。用琼脂糖凝胶电泳方法检测得到的DNA溶液。
　　1.2.3 ITS序列PCR扩增 PCR反应的引物采用通用引物ITS1、ITS4[1，13]，PCR反应所用的试剂是PCR Mix。25 μL的反应体系如下：模板DNA 1 μL;PCR Mix 12 μL;ddH2O 10 μL;P1和P2分别为 1 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30次循环;72 ℃最终延伸10 min。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色观察，检测合格样品进行序列测定与分析。
　　1.2.5 序列分析 将所得DNA序列输入GenBank进行BLAST比对检索，从NCBI数据库中调取22种白粉菌ITS保守序列，采用Clustalx1.83将测序白粉菌（BC180623）结果与不同白粉菌的ITS序列构建系统发育树，推演系统进化关系。
　　2 结果与分析
　　2.1 基因组DNA提取与PCR扩增的结果
　　 ITS通用引物扩增获得的目的片段用胶回收试剂盒回收并纯化，对所得结果进行电泳检测（图1），PCR扩增产物在回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序获得长度为603 bp的碱基序列，结果如下：2.3 百日菊白粉菌ITS序列进化樹构建结果与分析
　　 获得的序列用NCBI的BLAST进行序列搜索，从GenBank中选取部分植物白粉菌ITS序列与本试验测序结果进行比较分析（表1）。对表1白粉菌的ITS序列对比分析结果见图2。
　　 由图2可知，样品百日菌白粉菌BC180623的ITS序列与KF453969.1的ITS序列最为接近，相似度达到99%。两者序列差异性主要体现在第2、4、19、560、581、585位碱基上。说明样品百日菊白粉菌与KF453969.1具有较近的亲缘关系。此外，23种白粉菌ITS序列219 ～374 bp之间保留着较高的一致性，因此，这些区段有可能起到了保障白粉菌性状稳定遗传的功能。 　　 对23种白粉菌用MEGA 5.05软件分析处理，构建系统发育树（图3）。结果表明，23种白粉菌的ITS序列形成3个比较大的分支，本研究测序的百日菊白粉菌BC180623的ITS序列与发生在土耳其菊芋上的白粉菌（KF453969.1）、英国大波斯菊上的白粉菌（KY660959.1）、日本蓼属植物上的白粉菌（LC331790.1）的ITS距离最近，这说明本研究的白粉菌菌种与它们具有比较近的亲缘关系，从分子水平证明了发生在本地百日菊上的白粉病是Erysiphe cichoracearum所引起的。
　　3 讨论
　　 传统对于白粉菌的分类方法过多地依据寄主种类、危害症状与显微镜观察对菌物不同的形态特征进行比较和分类，通过对大量标本测量与数据的比对之后才能得出结论，这种方法不仅费力费时，经常由于研究者的主观因素导致片面甚至错误的结论，许多白粉菌由于种所处环境条影响，在附属丝等细微特征上也具有差别，因此导致鉴定效率、准确率比较低[14-15]。
　　 PCR技术是诊断植物病害的有效方法，它比起传统检测方法具有高灵敏性、快速、准确、简便等优点。ITS序列在不同真菌种内保守性强，而种间存在变异，根据这一特性用ITS研究真菌系统发育和检测已经成为有效的成熟手段[16-19]。郭徐鹏等通过对白粉菌ITS区DNA片段的提取扩增和分析，对陕西关中地区甘蓝型油菜白粉病的病原菌进行了分子水平上的鉴定[20]。文静等通过对内蒙古4种白粉菌的ITS序列分析，构建进化发育树，表明ITS序列可用于白粉菌属内和属间的亲缘关系和分类分析[21]。
　　 通过一对特异性引物ITS/ITS4，利用PCR扩增的方法，对发生在百日菊上的白粉菌DNA进行扩增并测序，将所获得的测序结果与已上传的白粉菌菌种进行BLAST比对，从中筛选相似度接近或较高的菌种数据建立系统发育树状图，发现引起该病害的白粉菌属于Erysiphe属，研究结果为该病原菌的检测、分类与鉴定提供理论依据，对此类病害的监测具有重要意义。
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