野生何首乌组织培养研究
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摘 要：选用广西百色当地野生何首乌为试验材料，以茎段为外植体，探究其最适宜的组织培养方案。结果表明：75%乙醇30s配合0.1%HgCl2消毒12min，可明显控制外植体的污染率，是茎段分段灭菌中最适宜的方案;初代培养中，诱导腋芽选择MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基进行培养，诱导率、总芽数及平均芽高均最高;无菌芽增殖时，添加50mL/L的椰汁配合6-BA 2.0mg/L，可得到最好的增殖率和芽数;生根培养以1/2MS+NAA 0.2mg/L+IBA 0.1mg/L为最适宜生根配方;高山土是野生何首乌组培苗适宜的移栽基质。
关键词：何首乌;组织培养;茎段
Abstract： In this study， the local wild Polygonum multiflorum in Guangxi was used as the research material， and the stems were used as explants to explore its most suitable tissue culture technology. The results showed that： 75% ethanol 30s with 0.1% HgCl2 disinfection for 12min could significantly control the contamination rate of explants， which was the most suitable scheme for segmental sterilization of stem segments; the selection of axillary buds in primary culture with MS+6-BA2.0mg/L+KT1.0mg/L+sucrose30g/L+agar 7g/L medium，which made the highest induction rate， total bud number and average bud height; 6-BA 2.0mg/L was added during sterile bud proliferation，The best growth rate and number of shoots were obtained with coconut milk 50mL/L; rooting culture with 1/2MS+NAA 0.2mg/L+IBA 0.1 mg/L was the most suitable rooting formula. The alpine soil was a suitable transplanting substrate for the wild Polygonum multiflorum tissue culture seedlings.
Key words： Polygonum multiforum; Tissue culture; Stem
何首烏（Polygonum multiforum Thunb.），又名首乌、夜交藤等，属蓼科多年生缠绕藤本植物。何首乌块根是我国传统大宗中药材，含有蒽醌类化合物、二苯乙烯苷类等多种成分，以及人体必需的多种氨基酸、微量元素。国内外医学研究[1-4]发现，何首乌具有降低血脂、提高血液循环等多种功效，对促进消化系统的代谢功能、调节内分泌肠道平衡有较大的益处[5-6]。梅雪[7]、王子璐[8]等研究表明，何首乌具有与肾上腺皮质激素具有同等作用的化学成分，可减少机体对脂质的吸收，抑制胆汁酸的合成，促进胆汁的下泄作用。何首乌可提高人体造血能力[9-10]。除此之外，何首乌的多糖成分对免疫功能的调节也有较好的效果[11-12]。
随着社会的快速发展，人们对补药的需求越发重视。由于何首乌具有延缓衰老、治疗脱发、白发、促进心脑血管的血液循环等多种突出效果，使得人们对何首乌的需求日益增多。国内外市场的巨大需求，导致野生何首乌乱挖滥采的现象越来越多，野生资源日渐枯竭，产量降低，引起市场的供求关系紧张，使得何首乌逐渐成为市场的紧俏货。何首乌以传统的种子、块根、扦插繁殖为主要栽培模式，而组织培养技术的应用推广范围依旧很窄，年供比达不到市场的需求量。张宗珍[13]、曾文丹[14]等研究表明，改变何首乌传统栽培方式具有必要性和紧迫性。当前，何首乌组织培养技术在我国的研究应用仍较少，曾文丹等[15]选用栽培何首乌嫩茎进行快繁技术探究，筛选出芽体灭菌的最佳时间8min，不定芽增殖激素选择是TDZ和NAA配合;袁红霞等[16]对块根诱导愈伤组织进行研究，得出块根消毒搭配是70%乙醇+0.1%升汞;MS+2，4-D2.0mg/L+6-BA0.5mg/L为最适诱导培养基。
本研究在前人研究的基础上，以野生何首乌茎段为外植体，探究不同因子对其组织培养的影响，为进行大规模种植，加快工业化生产，增加种苗来源提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料 本试验选用广西百色野生的何首乌，茎段均在试验时采摘的新鲜材料，藤蔓和叶片均无病害，符合试验选材要求。
1.2 试验方法
1.2.1 预处理及灭菌 选择健康无病害、病斑的野生何首乌枝条，流水冲洗干净，用手术剪将枝条剪成带腋芽的茎段。茎段分成3个部分，芽尖最上部分3～5个节间点为顶端部分、依次中部、下部，倒入洗衣粉溶液浸泡10min，流水冲洗15min，备用。在超净工作台上使用0.1%升汞配合75%乙醇对外植体灭菌，设置升汞灭菌时间6～12min。每个处理分别接种40管，每管接种1个，7d后观察统计茎段污染率。
1.2.2 茎段初代培养 选择MS为基本培养基，固定KT浓度、添加不同浓度6-BA激素探究诱导腋芽的效果。每处理分别接种40管，每管接种1个，30d后统计诱导率和出芽数。 1.2.3 无菌芽继代增殖培养 增殖培养基以添加6-BA2.0mg/L的MS培养基为基本培养基，在此基础上添加不同用量的椰汁（50～200mL/L）和马铃薯汁（50～200g/L）作为营养物诱导芽的增殖。每个处理分别接种30管，每管接种1个，30d后统计增殖率和平均芽数。
1.2.4 生根培养 生根培养以1/2MS为培养基，分别添加0.1～0.3mg/L的NAA和IBA配合进行诱导生根。每处理分别接种35管，每管接种1个，30d后统计生根率和平均根数。
1.2.5 移栽 试验采用菌渣、菜园土、泥炭、高山土为栽培基质进行何首乌组培苗移栽基质，每处理种40株，使用育苗盆栽培，置于遮阴大棚内，隔天浇水1次。30d后统计成活率和记录生长情况。
1.3 数据统计 相关计算公式如下：
污染率（%）=污染数/接种数×100;
存活率（%）=存活数/接种数×100;
诱导率（%）=诱导出芽数/接种数×100;
平均芽高=诱导出芽总高/出芽总数;
增殖率（%）=出芽数/接种总数×100;
平均芽数=出芽总数/接种总数;
生根率（%）=生根数/总接种数×100;
成活率（%）=移栽成活数/移栽总数×100。
2 结果与分析
2.1 不同部位茎段对灭菌效果的影响 由表1可知，何首乌茎段外植体的器官部分，不同部位对灭菌效果有很大的影响。从污染率来看，茎段的顶端部分灭菌情况最好，污染率最高仅为10%;而中部和下部的污染率高达40%，随着升汞时间的延长，污染率逐渐下降，最低为10%。因此，就污染率来看，茎段的顶端部位灭菌效果相对于中部和下部较好。从成活率的情况看，中部和下部的外植体成活率相对较高，成活率达100%;综合污染情况和成活情况，A3组、A9组的灭菌效果最好，说明顶端和下部的外植体在75%乙醇30s+0.1%升汞12min处理下的灭菌情况最佳。可见，选用茎段的顶端或者下部的外植体进行组织培养灭菌，容易取得较好的灭菌效果。
2.2 不同浓度6-BA对诱导腋芽的影响 以添加细胞分裂素的培养基进行初代培养，茎段接种培养后3d开始分化出部分腋芽，7d后腋芽基本分化完成。由表2可知，在细胞分裂素的诱导下，诱导率均达95%以上。B0在未添加6-BA的情况下，出芽的数量最少，芽的平均高度最低。从B1～B3看出，6-BA浓度在一定范围下可以促进外植体的出芽;随着6-BA浓度的提高，对芽点有一定的抑制作用。在B4处理的培养条件下，试验得出外植体的出芽数、诱导率、平均芽高等总体上的诱导分化效果最佳。因此，在何首乌茎段腋芽诱导试验中，MS+KT 1.0mg/L+6-BA 2.0mg/L的配比可得到最佳的腋芽诱导配方。
2.3 不同添加物对无菌芽增殖效果的影响 由表3可知，椰汁对无菌芽的增殖效果比马铃薯的增殖效果好，出芽数和芽总数均较高，增殖率达到83%以上，但总体处理的平均芽数均在2个左右。综合增殖率与出芽情况考虑，添加椰汁的处理方案MS培养基+6-BA 2.0mg/L+50mL/L椰汁为最佳增殖培养基。
2.4 不同生长激素对生根的影响 由表4可知，D4处理的生根率、生根总量以及生根情况总体较好。就生根率和生根总数而言，D3处理和D4处理的配方相差不大，不管是在叶片大小或是叶片颜色上都相差无几;但在根的大小上，D3处理的根相比其他的较为粗壮，而D4处理的根较细小。对比处理D1、D2、D5，在生根率上D1处理稍微好一些，但总体上在生根总数以及叶片大小上较另外2个，D1处理的生根优势也是不够好。因此，综合其他编号的生根激素配比效果，D4处理的生根配方为最佳生根培养基。
2.5 不同基质对组培苗移栽成活的影响 从图1可以看出，种于菌渣中的何首乌组培苗成活率最低，而种于菜园土、泥炭土和高山土的苗移栽成活率均高于60%以上，高山土做基质的成活率则高达90%。说明野生何首乌组培苗更适应生境土。
3 讨论
在本次试验中，从茎段的分段灭菌结果来看，顶部嫩茎的灭菌结果虽然较好，但由于嫩茎的抵抗力较差，耐药性能相对弱，其成活的数量也比另外2个处理少，中、下部外植体污染率较高，可能是中下部的组织成熟，其部分导管组织木质化中空，容易藏细菌，导致灭菌不够彻底，这在很大程度上影响了灭菌效果。而就成活率而言，中部和下部的外植体相对粗壮、成熟、组织耐药性较好，成活率相对较高。初代培养中，固定KT的浓度，设计6-BA浓度梯度研究对腋芽萌发的影响，结果表明，在空白对照B0的处理下，外植体的芽点最快发芽并在7d内全部抽芽;在0.5～2.0mg/L 6-BA浓度内，幼芽的长势较快，尤其是在2.0mg/L 6-BA时，幼芽的长势最旺盛，藤蔓也比较粗壮，叶片颜色较绿。B0的6-BA空白虽然在平均芽高上较低，但在抽芽时间、嫩芽叶片颜色、叶片大小上优于其他4个处理，因此，6-BA对何首乌腋芽萌发有促进的作用。椰汁添加量在50mL/L、马铃薯添加量为50g/L时，能有效提高增殖数量，添加量为100～200（mL/L或g/L）的处理上外植体的增殖率下滑。在试验中观察发现，椰汁处理的无菌芽生长叶色浓绿、较大、较多，茎较粗，而添加马铃薯的处理中，无菌芽的茎相对细小些，叶片较小。移栽试验中，种于菌渣中的苗原先在培养基中生长的根都枯萎同时生长新根少，可能是因为菌渣透气性太大，保水性差，根系无法吸收足够的养分和水分，导致根活力降低，成活率低，因而不适合做移栽基质。高山土做移栽基质成活率高，可能是模拟了野生何首乌的生境。
4 结论
本试验结果表明，75%乙醇30s配合0.1% HgCl2消毒12min可明显控制外植体的污染率，是茎段分段灭菌中最适宜的方案;初代培养中诱导腋芽选择MS+6-BA 2.0mg/L+KT 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培養基进行培养，诱导率、总芽数及平均芽高均最高;无菌芽增殖时添加50mL/L的椰汁配合6-BA 2.0mg/L，可得到最好的增殖率和芽数;生根培养以1/2MS+NAA 0.2mg/L+IBA 0.1mg/L为最适宜生根配方;高山土为野生何首乌组培苗适宜的移栽基质。 参考文献
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（责编：张宏民）
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