水质分析中两种总大肠菌群检测方法对比

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　　摘要：比较水质分析中酶底物法、纸片快速法这两种不同方法对总大肠菌群的检测效果。对2个有证标准样品（3 100 MPN/L和3 700 MPN/L）进行检测，考察上述两种方法的准确度;对低（400 MPN/L）、中（1.0×104 MPN/L）、高（3.0×106 MPN/L）3个细菌总数浓度样品进行检测，考察两种方法的适用性。结果表明：酶底物法的准确度更高;酶底物法适用于低中浓度细菌水样，纸片快速法适用于高浓度细菌水样。可根据实验准确度要求和不同水质污染程度选取合适的方法，以满足水质分析要求。
　　关键词：水质;总大肠菌群;检测方法;酶底物法;纸片快速法
　　中图分类号：R123.1    文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2020）03-0033-03
　　 微生物检测是水质环境监测的重要检测手段。在水质卫生质量评价和控制中，通常采用大肠杆菌作为指示菌，通过对指示菌的检测和控制来了解水体的受污染状况，从而评价其质量，以保证卫生安全。因此，需要探索、建立快速检测大肠杆菌的新方法。本课题对实验室常用的两种总大肠菌群检测方法——酶底物法和纸片快速法进行比较，考察方法的准确性及适用性，以期为有针对性地选取合适的检测方法提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　 有证标准样品3 100 MPN/L和3 700 MPN/L;低浓度（400 MPN/L）、中浓度（1.0×104 MPN/L）、高浓度（3.0×106 MPN/L）实际细菌水样;科立得Colilert酶底物法24 h试剂：美国爱德士公司;LCHJ755型系列（A）水质总大肠菌群快速测定纸片：广州力测生物科技有限公司。
　　1.2 仪器与设备
　　 LX-B75L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器;BOXUN SPX-250B-Z型生化培养箱;SEA Instrument Ouantitative sealing machine自动封口仪;97孔定量盘。
　　1.3 试验方法
　　1.3.1 酶底物法 无需在无菌室操作，可佩戴口罩、点酒精灯进行操作。1） 样品稀释。样品采集后2 h内检测，或在10 ℃以下冷藏不超过6 h。根据样品污染程度确定接种量，避免接种样品培养后97孔定量盘出现全部阳性或全部阴性。2） 接种。量取100 mL样品或稀释样品于灭菌后的三角瓶，加入2.7±0.5 g培养基粉末，充分混匀溶解后，全部倒入97孔盘内，以手抚平97孔定量盘背面，赶除孔内气泡，然后用定量封口机封口。观察97孔定量盘颜色，若出现类似或深于标准阳性比色盘的颜色，则需排查样品、培养基、无菌水等一系列因素后，终止试验或重新操作。3） 培养。将封口后的97孔定量盘放入恒温培养箱中37±1 ℃下培养24 h。4） 结果判读与计数。将培养24 h后的97孔定量盘进行结果判读，样品变黄色判断为总大肠菌群阳性，参见最大可能数MPN表分别记录97孔定量盘中大孔和小孔的阳性孔数量。5） 结果计算。从97孔定量盘法MPN表中查得每100 mL样品中总大肠杆菌群数的MPN值后，根据样品不同的稀释度，换算样品中总大肠菌群浓度。计算公式为：
　　C=MPN值×1 000/f
　　 式中：C为样品中总大肠菌群浓度，MPN/L;MPN值为每100 mL样品中总大肠菌群浓度，MPN/100 mL;1 000为将C的单位由MPN/mL转换为MPN/L;f为最大接种量，mL。
　　1.3.2 纸片快速法 所有操作均在无菌室进行。1） 接种细菌水样前准备。样品采集后2 h内检测，或在10 ℃以下冷藏不超过6 h。当每张纸片的接种量为10 mL或1 mL时，充分混匀水样备用;当每张纸片接种量为0.1 mL时，先制成1∶10的稀释水样。2） 接种。10 mL水样量纸片5张，各接种10 mL水样;1 mL水样量纸片10张，其中5张各接种1 mL水样，另外5张各接种1∶10的稀释水样1 mL。接种水样应均匀滴在纸片上，待纸片充分浸润、吸收水样，用水在聚丙烯塑膜外侧轻轻抚平，做好标记。3） 培养。在37±1 ℃的條件下培养18～24 h后观察结果。4） 结果判读。纸片上出现红斑或红晕，且周围变黄为阳性;纸片全片变黄，无红斑或红晕为阳性;纸片部分变黄，无红斑或红晕为阴性;纸片的紫色背景上出现红斑或红晕，而周围不变色为阴性;纸片无变化为阴性。5） 结果计算。根据不同接种量的阳性纸片数量，查MPN表得到MPN值（MPN/100 mL），换算并报告1 L水样中总大肠菌群数。计算公式为：
　　C=100×M/Q
　　 式中：C为水样总大肠菌群浓度，MPN/L;M为查MPN表得到的MPN值，MPN/100 mL;Q为实际细菌水样最大接种量，mL;100为10×10 mL，其中10为将MPN值的单位MPN/100 mL转化为MPN/L，10 mL为MPN表中最大接种量。
　　1.4 数据处理
　　 检测结果全部经对数（以10为底）转换后进行分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 标准样品两种方法准确度对比
　　 标样1为证书标准值3 100 MPN/L的标准样品，标样2为证书标准值3 700 MPN/L的标准样品。A表示采用酶底物法，B表示采用纸片快速法。对同一标准样品分别采用两种方法平行检测6次，计算RSD值，结果见表1。
　　 由表1可知：检测同一标准样品，酶底物法的RSD值小于纸片快速法，说明酶底物法检测准确度优于纸片快速法。查最大可能数MPN表，酶底物法的最低检出限为10 MPN/L，纸片快速法为20 MPN/L，可见酶底物法检出限低，优于纸片快速法。
　　2.2 不同浓度样品两种方法准确度比对 　　 对低浓度（400 MPN/L）、中浓度（1.0×104 MPN/L）、高浓度（3.0×106 MPN/L）实际细菌水样分别采用两种方法平行检测6次，计算RSD值，结果见表2。
　　 由表2可知：检测低、中浓度细菌水样，酶底物法的RSD值较小，准确度更高;高浓度细菌水样在浓度超过24 000 MPN/L时，兩种方法均无法计数，需要进行合理稀释后再检测。而实际操作中，稀释需在无菌实验室进行，考虑到纸片快速法本身就是在无菌室中进行，且成本较低，所以高浓度细菌水样适合采用纸片快速法检测。
　　 综上，酶底物法的优点是在实际操作中对环境要求不高，野外也能操作，步骤简单，准确度较高，检出限较低，对于低、中浓度细菌水样均适用;缺点是对高浓度水样稀释操作相对繁琐，价格高。纸片快速法的优点是价格低，对高浓度细菌水样稀释操作相对便捷。
　　3 结论
　　 通过比较实验室常用的两种总大肠菌群检测方法——酶底物法和纸片快速法，确定酶底物法检出限低，标准样品准确度高，操作简便，可满足实验室常规检测任务;对不同浓度细菌水样采用两种方法分析发现，酶底物法适用于低、中浓度细菌水样，纸片快速法适用于高浓度细菌水样。实验室可以根据实验准确度要求和不同水质污染程度选取合适方法，具有一定的实验室推广价值。
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　　Comparison of Two Methods for Detection of Total Coliform
　　Bacteria in Water Quality Analysis
　　HUANG Jiao
　　（Liaoning Geology and Mineral Research Institute Co.， Ltd.， Shenyang 110032， China）
　　Abstract： In order to compare the detection effect of enzyme substrate method and rapid paper strip method on total coliform bacteria in water quality analysis， the accuracy of two certified reference samples （3 100 MPN/L and 3 700 MPN/L） was tested; Low （400 MPN/L）， medium （1.0×104 MPN/L） and high concentration （3.0×106 MPN/L） bacterial water samples were used to compare the applicability of two different methods. The results showed that the enzyme substrate method was more accurate; the enzyme substrate method was suitable for low and medium concentration bacterial water samples， and the rapid paper strip method was suitable for high concentration bacterial water samples. Therefore the laboratory can select the appropriate method according to the requirements of experimental accuracy and the different water quality pollution degree to meet the test production requirements.
　　Key words： water quality; Total Coliform Bacteria; detection method; enzyme substrate method; rapid paper strip method
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