林麝源肺炎克雷伯氏菌新LysR家族转录因子的原核表达

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　　关键词：林麝;肺炎克雷伯氏菌;kp05372基因;原核表达
　　林麝（Moschus berezoviskii）为《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅱ和国家一级保护动物，其雄性分泌的麝香为名贵的中药材和高级动物香料，具有重要的社会价值和经济价值。人工养殖是林麝资源保护的主要对策之一，我国从1958年开始人工养殖林麝，历经半个多世纪，发展仍较缓慢。影响林麝人工养殖的一个重要原因是林麝化脓性肺炎疾病的发病率和死亡率高[1]。林麝患化脓性肺炎后前期一般不易发现，发现时已经处于较严重阶段，基本上无救治希望[2]。引起圈养林麝化脓性肺炎的病原菌种类繁多，包括大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌、巴氏杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌等多种病原[3-4]。
　　肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）属于肠杆菌科克雷伯菌属。自Friediander（1882年）首次从病人的肺组织中分离得到该菌后，在大熊猫、疣猴、金丝猴和林麝等多种珍稀动物体内均分离得到该菌[5-8]。该菌为条件性致病菌，在机体免疫力下降或长期使用抗生素导致菌群失调时，可引起人或动物感染肺炎、脑膜炎、肝脓肿、肠炎、腹膜炎等多种疾病[9]。在肺炎克雷伯氏菌基因组中分布着大量转录调节因子，其中LysR家族转录因子是最大的调节蛋白家族[10]，其调控的目的基因参与了细菌的毒力、新陈代谢、运动性、抗氧化、黏附和分泌等[11]。前期研究中，课题组在患化脓性肺炎和腹泻林麝的肠道中分离出1株肺炎克雷伯氏菌，该菌株对小鼠具有强致病性，全基因组测序分析发现，该菌株基因组序列中有1段序列大小为909 bp的编码序列（登录号：KX026659），命名kp05372，通过生物信息学方法分析发现，该基因为1个新的LysR家族转录因子，可能具有LysR家族转录因子相似的功能[12]。因此，本研究拟通过对该基因进行原核表达，以期为该基因的功能研究奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验菌株与质粒
　　林麝源肺炎克雷伯氏菌菌株由笔者所在实验室保存;感受态大肠杆菌DH5α和BL2（DE3），购自天根生化科技有限公司;克隆载体pMD19-T sample载体，购自大连TaKaRa公司;表达载体 pET-32a（+） 为笔者所在实验室保存。
　　1.2 主要试剂
　　细菌基因组DNA提取试剂盒及DNA Marker（DL2000）、DNA纯化回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、Western Blot试剂盒;限制性内切酶KpnⅠ、EcoRⅠ、D2000 plus DNA ladder、Trans 2K plus ⅡDNA Marker、蛋白质Marker、DNA T4连接酶、PVDF膜、考马斯亮蓝R250、IPTG和2×SDS凝胶上样缓冲液、抗His标签单克隆抗体、二抗（兔抗鼠）等。
　　1.3 pMD19-T/kp05372重组克隆载体构建与鉴定
　　运用Primer 5.0和Oligo 6.0设计扩增kp05372基因的特异性引物（P1：5′-GGTACCATGAACGGGATCAGTTTCAACC-3′，下划线碱基为KpnⅠ酶切位点;P2：5′-GAATTCTTAGCTGCGACGCTCCTG-3′，下划线碱基为EcoRⅠ酶切位点）。以GPKP菌株DNA为模板，进行kp05372基因的PCR扩增。PCR反应体系为：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 mmol/L P1引物1.0μL，10 mmol/L P2引物 1.0 μL，DNA模板 10 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将扩增产物进行电泳、胶回收和测序，测序结果与目标序列进行比对、验证，然后利用T4连接酶将其与pMD19-T载体16 ℃连接过夜，将连接產物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，然后取100 μL涂于含0.1 mg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上，37 ℃恒温培养16 h后，挑取单菌落分别接种于LB液体培养基中，37 ℃恒温振荡16 h。随后分别提取质粒，以P1、P2为引物，进行PCR和用KpnⅠ、EcoRⅠ单、双酶切验证。
　　1.4 pET-32a（+）/kp05372重组表达质粒构建与鉴定
　　利用KpnⅠ和EcoRⅠ酶对重组克隆质粒pMD19-T/kp05372和表达质粒pET-32a（+）双酶切。pMD19-T/kp05372质粒37 ℃酶切2 h，pET-32a（+） 质粒37 ℃酶切12 h，电泳分离酶切产物，然后胶回收目的片段，16 ℃连接过夜。连接反应体系如下：目的片段5.0 μL;pET-32a（+）片段1.0 μL;T4 Ligase 0.5 μL;T4 Ligase Buffer 1.0 μL;H2O 2.5 μL。最后将连接产物转入感受态细胞E.coli DH5α，涂布于含0.1 mg/mL Amp的LB固体培养基，于37 ℃培养箱中培养12 h，分别挑取阳性克隆菌株，提取质粒进行PCR和KpnⅠ、EcoRⅠ单、双酶切验证，对鉴定正确的重组表达质粒送公司进行测序。
　　1.5 重组蛋白的诱导表达及条件优化
　　将pET-32a（+）/kp05372重组质粒阳性E.coli BL21（DE3）接种于含0.1 mg/mL Amp的LB液体培养基中，37 ℃温度振荡培养至D600 nm约为0.6，分别加入IPTG至终浓度为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，诱导培养4 h，各取菌液 1 mL。同时，取部分IPTG浓度为0.6 mmol/L菌液离心，收集上清，用Tris-HCl（pH值=8.0）洗涤沉淀，超声波裂解菌体，离心，收集沉淀。同时，在IPTG浓度0.6 mmol/L组设置28、30、37 ℃温度梯度及1、2、3、4、5、6、7、8、9 h的诱导时间梯度。最后，分别在0.6 mmol/L菌液上清、裂解上清、裂解沉淀、不同IPTG浓度菌液、不同诱导时间菌液、不同温度梯度菌液沉淀样品中，加入25 μL PBS和 25 μL 2×SDS凝胶上样缓冲液，混匀后沸水煮 5 min，10 000 r/min 离心1 min，取10 μL上层液体SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝R250染色后脱色，利用凝胶成像系统分析目的蛋白的表达情况。同时，设置诱导的空载体pET-32a（+） BL21（DE3）转化菌作为对照。 　　1.6 重组蛋白免疫印迹分析
　　重组蛋白经SDS-PAGE，蛋白转印至PVDF膜上，TBST重复洗膜3次，5 min/次;然后4 ℃ 5%脱脂奶粉封闭过夜，加入抗His标签单克隆抗体37 ℃孵育1 h，TBST重复洗膜3次，5 min/次;加入 1 ∶ 4 000 倍稀释后的兔抗小鼠IgG/HRP 37 ℃孵育1 h，TBST重复洗膜3次，5 min/次;最后用ECL显色分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 pMD19-T/kp05372重组克隆质粒构建
　　采用PCR和单、双酶切对重组克隆质粒 pMD19-T/kp05372 进行验证，胶回收目的片段并进行测序，测序结果（图1和图2）分析表明扩增的基因片段序列及读码框正确，扩增片段长度为921 bp。
　　2.2 pET-32a（+）/kp05372重组表达载体构建
　　采用PCR和单、双酶切对重组表达质粒pET-32a（+）/kp05372进行验证，由图3和图4可知，鉴定结果与理论结果相符，表明目的基因片段已成功连上表达质粒。
　　2.3 重组菌最优表达条件的优化
　　重组阳性菌在不同温度（28、30、37 ℃），不同IPTG浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4 mmol/L），不同时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9 h）诱导后，收集菌体和上清。将菌体超声波裂解，收集上清和沉淀，SDS-PAGE检测，结果见图5、图6和图7，重组质粒在 37 ℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导表达 6 h 的重组蛋白表达量最高，大小约为53.2 ku。
　　2.4 重组蛋白免疫印迹分析
　　将抗组氨酸标签单克隆抗体作为一抗，HRP偶联IgG作为二抗，用增强型化学荧光（ECL）试剂作为底物显色液，免疫印迹分析结果见图8。
　　3 讨论
　　自人工养殖林麝以来，林麝的驯化期还较短，仍然保持警觉胆怯、易受惊和不易近人等野性。林麝患细菌性肺炎后一般不易发现，发现患病时已经处于较严重阶段，基本上无救治希望，以死亡而告终[2]。目前，对林麝细菌性肺炎的研究仍处于初始阶段，主要是集中在血液生理生化指标测定、病原分离鉴定、病理组织学观察及病原菌小鼠体内感染模型的构建上[13-15]，尚未有林麝化脓性肺炎发病机理研究。LysR家族转录因子在原核生物中参与了多种功能的调节，在细菌特定功能中扮演着重要角色[16]。对林麝源肺炎克雷伯氏菌新转录因子进行表达，对后期研究其参与的调控机制具有重要作用，可为探究肺炎克雷伯氏菌介导的林麝化脓性肺炎的发病机理奠定基础。
　　在蛋白的表达过程中，随温度、IPTG浓度、时间等诱导条件的改变，重组蛋白的表达量也发生改变。目标蛋白在37 ℃时表达量最高，IPTG浓度为0.6 mmol/L时，目的蛋白表达量最高，诱导时间为 1～9 h 时，KP05372蛋白的表达量都比较高，当诱导时间为6 h时，目的蛋白的表达量达到最高，这说明目的蛋白最佳诱导时间为6 h，Western-blot 结果表明，目的蛋白可与His标签的单抗发生特异性结合，说明重组菌可正确地表达。本研究成功构建了肺炎克雷伯氏菌GPKP菌株LysR家族转录因子原核表达载体，且在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达出目的蛋白，为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。
　　参考文献：
　　[1]姜俊庆，程建国，赵 位，等. 林麝源解没食子酸链球菌的分离鉴定及进化分析[J]. 中国兽医杂志，2017，53（10）：20-23.
　　[2]刘春燕.林麝Moschus berezovskii养殖种群死亡原因及其生命生理特征研究[D]. 上海：华东师范大学，2008.
　　[3]闫 敏，颜其贵，杨光友. 圈养麝的群发性疾病[J]. 经济动物学报，2016，20（2）：112-117.
　　[4]李秋波，颜其贵，康纪平，等. 麝化脓病细菌性病原诊断鉴定[J]. 野生动物，2012，33（4）：211-213.
　　[5]Lu M G，Jiang J，Liu L，et al. Complete genome sequence of klebsiella pneumoniae strain hkuoplc，a cellulose-degrading bacterium isolated from giant panda feces[J]. Genome Announcements，2015，3（6）：e01315-e01318.
　　[6]王艳君，冯永其，徐 静.东非黑白疣猴肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J]. 上海畜牧兽医通讯，2018（5）：14-15+17.
　　[7]郭定宗，胡薛英，周詩其，等. 金丝猴肺炎克雷伯氏菌及埃希氏大肠杆菌败血症的病理学观察[J]. 华中农业大学学报，2001，20（1）：60-62.
　　[8]Wei Z，Qing T，Yan L，et al. Isolation，identification，and genome analysis of lung pathogenic klebsiella pneumoniae（LPKP）in forest musk deer[J]. Journal of Zoo and Wildlife Medicine，2017，48（4）：1039-1048.
　　[9]Candan E D，Aksz N. Klebsiellapneumoniae：characteristics of carbapenem resistance and virulence factors[J]. Acta Biochimica Polonica，2015，62（4）：867-874.
　　[10]Henikoff S，Haughn G W，Calvo J M，et al. A large family of bacterial activatorproteins[J]. Proc Natl Acad Sci，1988，85（18）：6602-6606.
　　[11]Kovaleva G Y，Gelfand M S. Transcriptional regulation of the methionine and cysteine transport and metabolism in streptococci[J]. FEMS Microbiology Letters，2007，276（2）：207-215.
　　[12]赵 位，王吴优，程建国，等. 林麝肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其kp05372基因的生物信息学分析[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2017，45（12）：1- 7.
　　[13]何迟酩，林进生，邓家波，等. 林麝血液生理生化指标研究[J]. 四川动物，2012，31（3）：456-459.
　　[14]程建国，冯亚文，王 朋，等. 几种引起林麝肺部疾病病原菌的分离鉴定及药敏分析[J]. 中国兽医杂志，2013，49（12）：72-76.
　　[15]王吴优，田 青，程建国，等. 林麝肺源致病性大肠杆菌感染BALB/c小鼠模型的建立及评价[J]. 微生物学通报，2018，45（6）：1333-1341.
　　[16]Maddocks S E，Oyston P C. Structure and function of the LysR-type transcriptional regulator （LTTR） family proteins[J]. Microbiolog，2008，154（Pt 12）：3609-3623.李亚娇，孙国琴，郭九峰，等. 内蒙古锡林郭勒草原主要野生蘑菇分子进化及其系统发生学[J].
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