香合欢硬实破除及丛芽诱导

来源:用户上传      作者:许倩 林纬 黎起秦 袁高庆 赖家业

　　 摘 要：香合欢具有较好的经济价值，但由于种子硬实度较高，无法满足推广、利用的需求。本试验以香合欢成熟种子为材料，进行硬实破除及丛芽诱导研究。试验方法为：采用热水及98 %浓硫酸进行硬实破除;将切除子叶及大部分下胚轴后2 cm长的芽，接种到培养基上进行丛芽诱导。主要研究结果如下：热水处理最佳的硬实破除方式为85 ℃热水浸种24 h，发芽率和发芽势分别为80.00 %和95.56 %;98 %浓硫酸处理较好的硬实破除方式为酸蚀10～30 min，发芽率和发芽势均达到98.89 %～100.00 %;最佳丛芽诱导培养基为MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.3 mg/L。结论：种皮是造成香合欢种子休眠，萌发率较低的主要原因，而胚本身不含有影响其萌动的物质。香合欢属于较易于诱导丛芽的一种木本植物。
　　 关键词：香合欢 硬实破除 组织培养 丛芽诱导
　　 Abstract：Albizia odoratissima （L.f.） Benth has good economic value. However， due to the higher hardness of seeds， it is unable to meet the demands of development and utilization. In this experiment， the mature seeds of Albizia odoratissima were broken open and buds were induced. Method： Seeds were broken open with hot water and 98 % concentrated sulfuric acid.  Cluster buds were induced from cotyledon and 2 cm long buds of hypocotyl on the medium. Results：The optimum conditions of hot water treatment were as follows： soaking temperature 85℃， soaking time 24 h， under which the germination rate and germination potential were 80.00% and 95.56 %， respectively; treating with 98 % concentrated sulfuric acid for 10 ～30 min was the best， and the germination rate and germination potential reached 98.89 %～100.00 %.  The optimal medium for shoot induction was MS+ 6-BA1.0mg /L + NAA0.3mg /L. Conclusion： Hard seed coat causes dormancy and low germination rate， but embryo does not contain substances affecting germination. Albizia odoratissima （L.f.） Benth is a woody plant that is easy to induce shoots.
　　 Key word：Albizia odoratissima （L.f.） Benth;seed coat breaking; tissue culture; shoot induction
　　 香合欢（Albizia odoratissima （L.f.） Benth），又名牛角森、黑格，是豆科合欢属的高大落叶乔木，其主要分布于海南、四川、广东、广西、贵州、云南，多垂直分布于海拔800 m以下的低山、丘陵的中下部，是广西的乡土树种[1]。香合欢喜光，稍耐阴，较速生，心材比降香黄檀、格木成型更快。其幼龄时树皮浅灰色，具有皮孔，长大后变为黑褐色，呈鳞片状脱落。香合欢幼枝密被绒毛，长大后绒毛脫落。其叶为二回羽状复叶，叶柄基处有1枚腺体，小叶5～17对，基部偏斜，中脉明显。花为头状花序，黄色，且芳香，果为荚果，种子近圆形，暗褐有光泽，坚硬[2]。香合欢树干通直，具有较高的观赏价值，且具有较好的抗逆性，可作为园林行道树使用。
　　 香合欢木材美观，纹理致密，材质坚硬而厚重，稳定性强，干燥后不易开裂、变形，心材耐腐及抗虫蛀能力强，是做上等家具、雕刻、建筑、造船等的绝佳材料。不仅如此，其树皮含鞣质12 %～15 %，可作为栲胶原料。香合欢具有耐旱、耐高温、耐贫瘠、适应性强的特点，对改良土壤，改善生态环境具有良好的作用[3]。香合欢的经济价值较高，又因其属于豆科植物，有与根瘤菌共生的特性，因而对改良土壤改善林建生态环境具有重要的作用。
　　 香合欢主要依靠种子繁殖，但由于其种子表皮坚硬致密，吸水能力差，阻碍种子的萌发。且种子具有特殊气味，容易引来昆虫啃食，导致种子繁殖效率不高。因此，对香合欢进行植物组织培养方面的研究，对合理开发利用香合欢具有重要的意义与价值。本文从香合欢硬实破除方法和香合欢的丛芽诱导2个方面对香合欢进行研究，为下一步香合欢快繁提供技术依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　 所选用的种子为广西百色市雅长林场于2019年1月18日采集的香合欢2号母树成熟、饱满的种子。
　　 组织培养所用培养基为1/2 MS，3/4 MS，MS培养基，均附加琼脂7 g/L，蔗糖30 g/L，pH为5.8。
　　1.2 方法 　　 将供实验的成熟香合欢种子用水选法剔除杂质、虫粒、不饱满的种子后，在自来水下冲洗干净，用于试验。
　　1.2.1 香合欢种子硬实破除方法
　　 热处理：将种子分别浸泡在盛有常温水（25℃），60℃，70℃，85℃，100℃的烧杯中，加盖自然冷却，以将种子浸泡在常温水（25℃）中作为对照，24 h后，将种子置于27℃，光暗各12 h交替的光照条件下进行萌发测试，每组30粒种子，每组处理3次重复。
　　 酸蚀处理：用98 %的浓硫酸处理0 min，5 min，10 min，20 min，30 min，处理的过程中需不停搅拌，防止种子碳化。处理后用清水冲洗至中性，置于吸水纸上晾干，将种子浸泡在盛有常温自来水的烧杯中为对照，然后将种子置于27℃，光暗各12 h交替的光照条件下进行萌发测试，每组30粒种子，每组处理3次重复。
　　 种子开始萌动时进行记录，每天观察统计萌发数，第5 d计算发芽势，第10 d计算发芽率。发芽标准为胚芽长出，长度为种子长度的一半。以连续 5 d平均发芽率不足 1%的日期为统计发芽率的日期。按标准GB 2772-81中规定的方法进行检验，统计正常发芽粒数。3次重复未超出ISTA规程中规定的最大容许差距时，计算平均值作为有效试验结果。
　　1.2.2 香合欢的丛芽诱导
　　 在预实验中发现，氯化汞溶液会对已吸胀的种子造成一定程度的毒害作用，导致种子无法萌发或生长异常，因此，本实验中采用85 ℃热水处理后，尚未吸胀的种子作为实验材料。
　　 用85 ℃热水浸种24 h至自然冷却。然后，挑选出尚未吸胀的种子，用干净的滤纸吸干表面水分后放入75 %乙醇中灭菌，期间不时摇动。30 s后取出，用无菌水冲洗2次，放入0.1 %氯化汞溶液中对外植体进行灭菌10 min。随后用无菌水冲洗5～6次。最后，用消毒滤纸吸干材料表面的水分后，将种子接种到MS培养基中进行培养。之后，将长势基本一致的无菌苗去除子叶及大部分下胚轴后，保留2 cm左右的芽，接种到诱导培养基中进行培养。培养室条件为温度25±2℃，光照强度1000～3000 lx，光照时间10 h/d。培养基按照三因素三水平的正交试验设计，共设置以下10种诱导培养基（见表1）。
　　 每组处理接种30个外植体，重复3次，每瓶接种2个外植体。每7 d观察1次，记录好样品形态的变化，28 d后统计外植体的丛芽诱导数、增值系数、有效外植体获得数等情况进行统计分析，从中筛选出适宜香合欢无菌实生苗丛芽诱导最适宜的培养基。
　　1.2.3 数据统计
　　 发芽势（Gv）%=（5 d内种子的发芽数/供试种子数）×100
　　 发芽率（Gr）%= （10 d内发芽种子数/供试种子数）×100
　　 丛生芽诱导率（%）=（诱导出丛生芽的外植体数/外植体总数）×100。
　　 增值系数=分化芽数/接种芽数。
　　 有效外植体获得数：将较为健壮的丛芽切成2 cm左右带1～2个芽点的小段进行继代。将转接出的每1个外植体记为1。
　　1.2.4 数据处理
　　 采用DPS7.05统计分析软件进行数据分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和新复极差法（Duncan法）进行显著性检验。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同硬实破除方法对香合欢种子萌发的影响
　　 由表2可看出，热水和98 %浓硫酸处理均能在不同程度上促进香合欢种子的萌发，种子的发芽率、发芽势均与对照组（常温水处理）相比有不同程度的提高。不同处理间的发芽率存在显著差异。热水处理的种子，其发芽率存在着先升高后降低的现象，在60 ℃～85 ℃的浸种处理范围内，种子的发芽率和发芽势均随着水温的升高而增加，并在85 ℃时达到最大值95.56 %和80.00 %，比对照提高83.34 %及72.22 %。当温度达到100 ℃时，水温使种胚受到损伤，容易发生腐烂的现象，种子的萌发受到影响，发芽率呈现下降趋势。浓硫酸处理时，处理时间为20 min和30 min发芽率最高，达到了100 %，但与98 %浓硫酸处理10 min差异不显著，与98 %浓硫酸处理5 min差异显著，所以，98 %浓硫酸处理10～30 min在發芽率上取得的效果更好，并且此时发芽势较高，达到了98.89 %～100.00 %，比对照组提高了91.11 %～92.22 %。综合上述，对破除香合欢硬实的较好处理方式为85 ℃热水处理24 h和98 %浓硫酸处理10 ～30 min。
　　2.2 不同培养基及外源激素浓度对丛芽诱导的影响
　　 培养28 d，10种培养基上的丛芽诱导情况如表3所示。对单项指标分析如下：
　　 在丛芽诱导率方面，各处理间的差异达到显著水平。与对照组（C0）相比，其他几组对丛芽诱导均能取得较好的效果，但是，它们相互之间的差异不显著。其中，C5的丛芽诱导率最高，达到了96.67 %，比对照组提高了62.23 %。香合欢在不加任何激素的情况下，虽然也能够诱导出一定数量的丛芽，但每丛为2～3个芽，数量并不多。而在添加激素后，丛芽诱导率显著提升。其中C5，C6，C7，C8诱导效果较好，几乎每丛均能诱导出每丛4～6个芽。这说明香合欢在以芽作为外植体时，容易诱导出丛芽，并且这些诱导出的芽均有较为明显的高度增长。
　　 在增值系数方面，各处理间的差异达到显著水平。其中，C5，C6，C7，C8增值系数较高。但C7，C8诱导出来的芽在芽高增长量及健壮程度上比C5，C6更好。
　　 在有效外植体获得数方面，各处理间的差异达到显著水平。即通过改变盐浓度及激素含量，能够对有效外植体获得数产生一定的影响。其中，C5，C6，C7，C8与其他组存在显著差异。尽管C5能获得较多的外植体，但是在苗的质量方面不及C6，C7，C8。 　　 综合所有指标进行分析，本试验认为C7即MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.3 mg/L为最优的丛芽诱导培养基。
　　3 讨论
　　 种子休眠是植物进化过程中长期适应环境的一种重要的自我保护的方式[4]。导致种子休眠的原因有很多，硬实便是其中一个。硬实性是大多数豆科植物种子的特性，通过对豆科硬实种子解剖结构研究发现，硬实种子拥有坚硬的表皮主要是由于其种皮具有发达的角质层及广泛发育的栅栏状细胞与骨状石细胞[5]。硬实性对于延长种子的寿命，促进植物远距离传播十分有利[6]。但是硬实性也阻碍了种子的萌发，未经处理，会造成发芽率过低的情况。在本研究中，利用热水和浓硫酸对香合欢进行硬实破除。热水处理主要是利用较高的水温，使坚硬的种皮龟裂成一种疏松多缝的状态，以解除休眠，促进种子萌发。而浓硫酸处理则是利用其强氧化性，腐蚀并破坏种皮结构[7]。实验中发现，热水处理的最佳方案为85 ℃浸种24 h，发芽率和发芽势分别为80.00 %和95.56 %;用98 %浓硫酸处理较好的方案为浓硫酸处理10～30 min，通过这种方式可以实现香合欢发芽率和发芽势达到98.89 %～100.00 %。由结果分析可知，造成香合欢种子休眠，萌发率较低的主要原因是：种皮阻碍水分进入种子，影响种子的吸胀、萌发，而种胚本身并不含有影响其萌动的物质。在冯圆等对合欢硬实破除方法的研究中，采用不同水温浸种及浓硫酸酸蚀的方法进行种子的处理。当水温为50 ℃～60 ℃且浸泡时间为2 d时，种子的发芽率为97 %，发芽势为90 %。当酸蚀30 min+常温水浸泡3 d时，发芽率及发芽势为100 %和97 %[8]。可见，同科同属的合欢及香合欢在种皮结构上存在着一定的差异，因此，最佳的破除硬实方式会存在一定的不同。
　　 植物组织培养是利用细胞全能性，进而培育出完整植株体的一种技术[9]。通过这种方式，能够更快速、高效地繁殖有较高经济价值的植物。在本研究中香合欢丛芽诱导培养最佳培养基为C7：MS+6-BA1.0 mg/L +NAA0.3 mg/L。具体表现为丛芽的诱导率及增值系数较高，每个丛芽的平均芽数较多且芽较壮，同时，有效外植体获得数较多，与其他处理方式差异显著，达到了快速繁殖试管苗，且节约材料和生产成本的目的。在国外对香合欢的组培研究中，以上胚轴作为外植体，最佳平均每个外植体诱导出15个芽。这种方式虽然诱导出的芽更多，但比本研究多经历愈伤组织诱导阶段，耗费的时间相对更长，且最佳愈伤组织诱导率为85.00 %，最佳芽诱导率仅为66.00 %[10]。通过这种方式对香合欢进行组培，耗费的生产成本相对会更高一些。外植体的选择对组培效率有着重要影响，应当进行对比，筛选出更为快速经济的方式进行植物组培。
　　参考文献
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　　[10]    Rajeswari V， Kailash P. In vitro adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from seedling explants of Albizia odoratissima L.f. （Benth.）[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant， 2008， 44（2）： 78-83.
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