蜡样芽孢杆菌0-9对小麦根腐病菌的抑菌作用研究
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作者:黄秋斌 韩兴旺 刘凤英
摘要 采用平板对峙法，研究0-9菌株对引起小麦根腐病的致病菌尖孢镰刀菌的抑菌作用，抑菌率为50%，该菌株发酵代谢产物对小麦根腐病菌的抑菌作用达83%;0-9菌株代谢产物处理尖孢镰刀菌的分生孢子后，其萌发率降低61.2%;发酵代谢物质在高温和长时间紫外线照射下仍具有约80%的抑菌活性，且代谢产物的有效抑菌活性可以长达14 d。同时采用平板对峙法研究0-9菌株对5株植物病原真菌的抑菌作用，结果表明0-9菌株也具有广泛的抑菌效果。
关键词 蜡样芽孢杆菌0-9 ;代谢产物;小麦尖孢镰刀菌;抑菌活性
Abstract The bacteriostatic effect of strain 0-9 on Fusarium oxysporum，which caused wheat root rot，was studied by plate confrontation method.The bacteriostatic rate of Fusarium oxysporum was 50%.The bacteriostatic effect of fermentation metabolites on Fusarium oxysporum was 83%.After the conidia of Fusarium oxysporum was treated with metabolites of strain 0-9，the germination rate decreased by 61.2%，and the fermentation metabolites still had about 80% bacteriostatic activity under high temperature and long time ultraviolet irradiation，and the effective bacteriostatic activity of metabolites could be as long as 14 days.At the same time，the bacteriostatic effect of strain 0-9 on 5 strains of plant pathogenic fungi in laboratory was studied by plate confrontation method.The results showed that strain 0-9 also had a wide range of bacteriostatic effects.
Key words Bacillus cereus 0-9;Metabibolites;Fusarium oxysporum;Activity
小麦根腐病是比较普遍的一种小麦病害，在东北、华北和西北地区发生比较严重，能够严重影响小麦的产量和品质，是由多种病原菌入侵小麦根部所造成，主要致病菌以麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）和尖孢镰刀菌属（Fusarium oxysporum）为主。目前常用的防治手段有物理方法、种子化学药物包衣及生物方法[1-2]。物理防治手段主要采用农作物轮作的方法，防治效果有限，受环境条件影响较大，而化学防治手段则是通过化学药物三唑类杀菌剂与小麦种子拌种来防治，但长时间使用杀菌剂会造成环境污染，诱导病菌抗性增强，破坏生态平衡[3]。生物防治方法则是利用环境微生物和提取物来进行防治，具有有效、安全和持久的特点，近年来备受关注。目前常用的生物防治微生物主要有内生细菌、内生真菌、放线菌等多种菌群[4-6]，其中芽孢杆菌属抗逆能力强，繁殖速度快，对生长要求简单，可以产生细菌素、酶类、活性物质、脂肽等抗菌物质，在自然界中广泛存在于植物内，是一种理想的生防微生物，但目前对小麦根腐病防治的微生物研究很少[7-10]。蜡样芽孢杆菌0-9（Bacillus cereus）是从小麦根部中分离得到的内生细菌，具有很好的抑菌作用[11]，笔者研究0-9菌株对小麦根腐病菌尖孢镰刀菌活性的影响及其发酵代谢物质的稳定性，为探索该菌株的抑菌机制以及开发应用生防制剂提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
蜡样芽孢杆菌0-9由河南大学资源分离与微生物实验室分离保存，保存于-80 ℃。小麦禾谷丝核菌（Rhizoctonia zeae）、绿豆立枯丝核菌（ Rhizoctonia solani）、玉米弯孢霉叶斑病（Curvularia lunata Boedijn）、西瓜炭疽病菌（Colleetotrichum lagenarium）、尖镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp cucumerinum）、小麦尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）6种真菌均由河南大学资源遗传与分离实验室提供，保存于4 ℃。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株的活化。
0-9菌株活化：取甘油管保藏菌，在固体LB培养基（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，121 ℃灭菌20 min）上划线活化，挑取新鲜单菌落接入100 mL液体LB培养基中，30 ℃、200 r/min条件下振荡培养18 h，4 ℃条件下保存备用。
植物病原真菌的活化：取病原真菌试管斜面，用接种针挑取真菌菌丝放置于PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖10 g，琼脂粉15 g，1 000 mL ddH2O，115 ℃灭菌20 min）上，于25 ℃培養箱繁殖培养7 d，4 ℃条件下保存备用。
1.2.2 蜡样芽孢杆菌0-9菌株对植物病原菌菌丝生长的测定。
将活化后的0-9单菌落转接于100 mL LB液体培养基内，30 ℃、200 r/min振荡培养18 h，后12 000 r/min离心收集菌体，并用无菌水悬浮菌体，4 ℃保存备用;在PDA培养基平板上距中心位置接种直径为8 mm的病原菌菌饼，后在平板周围距离该菌饼2.5 cm的位置加入5 μL 0-9细菌菌悬液，以5 μL 无菌水作为对照，后放置于25 ℃培养，培养6 d后观察结果，采用十字交叉法测量病原菌直径，对照病原菌直径记为A，处理病原菌直径记为B，计算抑菌率： 抑菌率=[（A - B）/ A]×100% 1.2.3 蜡样芽孢杆菌 0-9菌株代谢产物对小麦尖孢镰刀菌活性测定。将活化后的0-9单菌落转接于100 mL PDA液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养24 h，后在12 000 r/min离心收集上清，用0.22 μm的滤头过滤除菌，配制不同浓度（10-1倍、10-2倍）的混合液，后与冷却至45 ℃的100 mL固体PDA培养基混合倒平板，待冷却后在平板中心接种直径8 mm 的病原菌菌饼，以PDA培养基为对照，放置于25 ℃培养，6 d后观察小麦尖孢镰刀菌在平板上的生长情况。
1.2.4 蜡样芽孢杆菌0-9代谢产物对孢子萌发的测定。
小麦尖孢镰刀菌在PDA平板培养14 d后，加入10 mL无菌水洗脱孢子，用8层纱布过滤除去菌丝碎片，3 000 r/min慢速离心，清洗2次后获得孢子悬液，然后将不同梯度的代谢产物和孢子悬液等比例混合，放到凹玻片中，置于25 ℃培养箱中黑暗条件下培养24 h，40×显微镜下观察并统计孢子萌发数，计算孢子的萌发率。
1.2.5 蜡样芽孢杆菌0-9代谢产物稳定性的测定。
（1）热稳定性。将过滤后代谢产物分别在40、60、80、100和121 ℃处理10 min，后与100 mL固体PDA培养基混合倒平板，待冷却后在平板中心接种直径8 mm 的病原菌菌饼，以PDA培养基作为对照，放置于25 ℃培养，培养6 d后采用十字交叉法测量病原真菌直径，计算抑菌率。
（2）紫外线稳定性。取过滤后0-9菌株代谢产物放置在超净台内紫外线（功率21 W，距离70 cm）照射处理，处理时间为0、10、20、30和60 min，处理完毕后与100 mL固体PDA培养基混合倒平板，待冷却后在平板中心接种直径8 mm的病原菌菌饼，以PDA培养基作为对照，放置于25 ℃培养，培养6 d后采用十字交叉法测量病原真菌直径，计算抑菌率。
（3）代谢产物的有效时间。把过滤后0-9菌株代谢产物在25 ℃条件下分别放置1、3、7和14 d，后与100 mL固体PDA培养基混合倒平板，待冷却后在平板中心接种直径8 mm 的病原菌菌饼，以PDA培养基作为对照，放置于25 ℃培养，培养6 d后采用十字交叉法测量病原真菌直径，计算抑菌率。
2 结果与分析
2.1 蜡样芽孢杆菌0-9对小麦尖孢镰刀菌的抑菌作用
从图1可以看出，采用平板对峙法培养后，蜡样芽孢杆菌0-9菌株对小麦尖孢镰刀菌具有很好的抑制作用，其抑制率可达50%，差异性比较明显。
2.2 0-9菌株代谢产物对小麦尖孢镰刀菌活性的影响
从图2可以看出，平板经过25 ℃培养5 d后，0-9菌株代谢产物对小麦尖孢镰刀菌的活性具有很高的抑制率，可达85%;稀释100倍后对病原真菌小麦尖孢镰刀菌仍具有一定的抑制性，可达62%，说明0-9代谢产物对小麦尖孢镰刀具有很强的抑制活性。
2.3 0-9菌株代谢产物对分生孢子萌发的影响
经过代谢产物处理后的孢子萌发率为22.5%，而不经过处理的孢子萌发率为83.7%，且100倍、10倍稀释的代谢产物处理后孢子萌发率分别为45.2%、36.7%，比对照组低，说明0-9菌株产生的代谢产物能够影响分生孢子的萌发。
2.4 0-9菌株代谢产物的稳定性
2.4.1 温度的耐受性。从图3可以看出，0-9菌株代谢产物经过不同温度处理后还表现出对小麦根腐病一定的抑菌活性，其中30和40 ℃处理后抑菌活性无明显变化，抑制率达84%;100和121 ℃高温处理后抑菌活性有所下降，但下降趋势不明显，抑制率达76%，说明该代谢产物对小麦根腐病的抑菌活性受温度的影响很小，对温度具有很好的耐受性。
2.4.2 紫外线的耐受性。通过对0-9菌株代谢产物进行不同时间的紫外线处理后测定抑菌活性，结果见图4。从图4可以看出，没有紫外线处理的，其抑菌活性为83%，经过紫外线处理10、20、30、60 min后，抑制率可达81%，抑菌活性无明显变化，说明该代谢产物对紫外线不敏感，其对小麦根腐病的抑制性比较稳定。
2.4.3 有效时间的稳定性。0-9菌株代谢产物放置4 ℃冰箱1、3、7、14 d后测定抑菌活性，结果见图5。从图5可以看出，代谢产物放置一段时间后，抑菌活性和对照组相比无明显变化，抑制率仍可达80%～82%，说明0-9菌株代谢物质不随着放置时间的变化而变化，对小麦根腐病的抑菌活性稳定性较好。
2.5 0-9菌株代谢产物对5种植物病原真菌的抑制作用
从图6可以看出，蜡样芽孢杆菌0-9对5种真菌均有一定的抑制作用，其中对西瓜炭疽病菌抑制较为明显，抑制率为60%;其次是对尖孢镰刀菌黄瓜转化型和玉米弯孢霉叶斑病2种真菌的抑制，其抑制率分别为26.7%和25.0%;对小麦禾谷丝核菌和绿豆立枯丝核菌的抑制效果较低，其抑制率分别为16.7%和18.0%。
3 结论与讨论
目前，生防菌的研究还停留在实验室阶段，在实验室条件下具有很好的抑菌活性，而在大田条件下，受到温度、紫外线、酸碱度等环境变化，生防菌及其代谢产物则不能很好地适应环境而发挥抑菌作用[12-13]，该研究中蜡样芽孢杆菌0-9（Bacillus cereus）是从小麦根部分离得到的内生细菌，通过平板对峙试验发现对引起小麦根腐病的病原真菌小麦尖孢镰刀菌均有一定的抑制作用，其抑制率可达50%，为此研究0-9菌株及其代谢产物对小麦根腐病的抑制作用机制。通过对0-9代谢产物进行分析发现其对小麦尖孢镰刀菌抑制作用较为明显，可达83%，说明0-9菌株能够产生较强的次生代谢产物，且该代谢产物能够抑制分生孢子的萌发，使菌丝局部膨大，不规则，生长缓慢异常。此外，发酵产生的代谢产物能够保持很强的稳定性，在高温、紫外线等条件下也能够发挥对病原真菌的抑制作用，且0-9菌株对小麦禾谷丝核菌、绿豆立枯丝核菌、玉米弯孢霉叶斑病、西瓜炭疽病菌、尖镰孢菌黄瓜专化型5种真菌具有广泛的抑制作用，为该菌株应用于大田环境提供理论基础。目前0-9菌株代謝产物中发挥抑制作用的具体物质是哪种还不是很明确，下一步工作需要研究该物质的具体成分以及提取条件的优化，从而为该菌株作为生防制剂防治小麦根腐病的应用开发提供条件。
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