多管发酵法与滤膜法测定水中粪大肠菌群的对比研究
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摘 要：多管发酵法和滤膜法是我国现有的环境标准分析方法体系中主要的粪大肠菌群检测方法。本文通过使用IDEXX公司提供的32份粪大肠菌群质控标样进行比对检测，了解2种方法的吻合度，并通过分析检测过程中的各种影响因素和方法優缺点，以判断2种方法更适合的水质检测。
关键词：多管发酵法;滤膜法;影响因素;优缺点
中图分类号：S-3
文献标识码：A
粪大肠菌群是在44.5℃条件下能发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌[1]。粪大肠菌群的监测是相关环保标准和环保工作的需要。我国有9个标准中规定了浓度限值和排放限值。在我国，多管发酵法是各级环境监测部门普遍采用的经典方法，我国现有的环境标准分析方法体系中，粪大肠菌群的主要检测方法为多管发酵法和滤膜法。本研究旨在将2种方法进行对比，了解2种方法的吻合度和优缺点。
1 实验部分
1.1 实验原理
1.1.1 多管发酵法[2]
将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管中，指示产气。44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐3号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为粪大肠菌群。通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。
1.1.2 滤膜法[3]
样品通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于MFC选择性培养基上，在特定的温度（44.5℃）下培养24h，胆盐3号可抑制革兰氏阳性菌的生长，粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过呈蓝色或蓝绿色菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。
1.2 水样的采集
距水面约10～15cm处采样，采集样品盛装于灭菌的采样瓶中。
1.3 试剂
1.3.1 多管发酵法
单倍乳糖蛋白胨培养基、3倍乳糖蛋白胨培养基、EC培养基。
1.3.2 滤膜法
MFC培养基。
1.4 实验步骤
1.4.1 多管发酵法
根据水样污染程度，确定水样接种量。将水样接种到乳糖蛋白胨试管中，在37±0.5℃下培养24±2h进行初发酵。轻微振荡在初发酵试验中产酸产气或只产酸未产气的试管，用火焰灼烧灭菌冷却后的接种环，将培养物分别转接到装有EC培养基的试管中，在44.5±0.5℃下培养24±2h。培养后立即观察，导管中产气证实为粪大肠菌群阳性。根据阳性管数查MPN表换算样品中粪大肠菌群数。
1.4.2 滤膜法
先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。根据样品的种类判断接种量，最小过滤体积为10mL，若接种量<10mL时应逐级稀释。将样品充分混匀后抽滤，以无菌水冲洗器壁2～3次。用灭菌镊子夹取滤膜移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，将培养皿倒置，放入恒温培养箱内，44.5±0.5℃培养24±2h。计数阳性菌落。
2 实验结果与讨论
2.1 水样检测结果
使用IDEXX公司提供的粪大肠菌群质控标样，对滤膜法和多管发酵法进行方法质控，检测的结果见表1。由表1可知，滤膜法和多管发酵法的检测结果均在质量控制可信度区间内。但滤膜法测定的结果要略低于多管发酵法测定的结果。
2.2 实验过程的影响因素
滤膜法受滤膜孔径的影响，不能检测浊度大、非大肠杆菌类细菌密度大的水样。对于浊度大或污染严重的样品，需先稀释后再抽滤，但稀释度越大，误差越大[4];滤膜法每轮抽滤结束后，要对抽滤设备充分灭菌，否则会影响后面样品的检测结果。
多管发酵法初发酵时，因单倍乳糖蛋白胨培养基中的接种量仅为1mL，在样品浓度比较低的情况下，易出现阳性结果不明显的发酵管，需认真观察，将疑似阳性的初发酵管也转接进行复发酵;多管发酵法培养基分装灭菌时，发酵管内倒管中的气泡一定要排尽，否则会在发酵结束后的判定时出现假阳性结果;多管发酵法吸取不同浓度的稀释液时，每次必须更换移液管，否则会造成检测结果的不准确。
2.3 方法的优缺点
多管发酵法是粪大肠菌群检测的经典方法，可用于检测各种水样，其它方法的研究都是与多管发酵法进行准确度和可靠性的比较，但其操作步骤繁琐，检测周期长，培养基保存时间短，工作量大，干扰因素多，需要消耗大量的人力和物力的缺点，已经不能满足当前国内外的检测需求。
滤膜法可检测体积较大的水样，操作简单，一次到位，避免操作过程中的二次污染，但稀释度越大，误差越大。受孔径影响，不能检测浊度大、非大肠杆菌类细菌密度大的水样。
3 结论
本实验使用IDEXX公司提供的32份粪大肠菌群质控标样，分别用滤膜法和多管发酵法进行检测，检测结果均在质量控制可信度区间内，滤膜法测定的结果要略低于多管发酵法测定的结果。滤膜法操作简单，一次到位，适合于比较清洁的水质;而多管发酵法可适用于各种水质。
参考文献
[1] 张少峰，刘国强，魏春雷.粪大肠菌群检测方法及研究进展[J].海洋通报，2008（03）：102-106.
[2]HJ347.2-2018，水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法[S].
[3]HJ 347.1-2018，水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法[S].
[4]戴巧容，刘育，李燕.多管发酵法与滤膜法测定水中粪大肠菌群的探讨[J].科技创业家， 2012（13）：213.
（责任编辑 周康）
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