?耐铅菌株的分离鉴定及其吸附特性研究

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　　摘 要：以某工厂处理水剩余污泥为菌种来源，经过分离、培养，筛选出一株最大耐Pb2+浓度为800 mg/L的耐铅菌株，命名为J2，应用16S rDNA基因测序，结合形态观察和生理生化特性试验确定其类别，并对其Pb2+去除特性进行初步研究。结果表明：J2菌株属于寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）细菌;其去除铅的最佳pH值为9、最适接种量为5%、最适温度为30℃、最佳发酵时间为96 h;根据J2菌株吸附铅前后扫描电镜结果，结合菌株生长曲线分析，认为J2菌株对铅的去除机理包括前期表面吸附和后期胞内累积或转化2种形式。该菌株可为重金属污染土壤微生物修复提供菌种资源。
　　关键词：土壤重金属污染;耐铅菌株;筛选;鉴定;吸附特性;吸附机理
　　中图分类号：Q815， X172 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2020）07-0005-04
　　Abstract： A lead-resistant strain survived in a maximum Pb2+ concentration of 800 mg/L was selected from the excess sludge of a plant and named J2 after isolation and culture. The obtained strain was subjected to 16S rDNA sequencing in succession to morphological observation， and physiological and biochemical charteristics tests. It was identified as Stenotrophomonas sp. based on 16S rDNA sequence similarity analysis. In addition， its Pb2+ removal characteristics was identified. The optimal lead adsorption conditions of this strain are pH 9，  inoculum concentration 5%， 30℃ and incubation 96 h. The repair mechanism of J2 strain is mainly cell surface adsorption at early stage and intracellular enrichment/transformation at late stage based on the analysis of the growth curve and scanning electron microscopy. Our studies confirm that the screened strain J2 has a good adsorption effect on lead and can provide bacteria resources for microbial remediation of heavy metal contaminated soil.
　　Key words： soil heavy metal pollution; lead-resistant strains; selecting; identification; adsorption characteristics; adsorption mechanism
　　在自然中大多数重金属都以低浓度存在于土壤、水、岩石和生物群中，为生命系统提供必需的营养，一旦某种或某几种重金属的含量过高便会引起毒性。铅是一种自然普遍存在的金属，但是因为人类活动极大地提高了其在环境中的含量，例如铅矿开采、使用铅作为原料的工业过程、煤炭和石油的燃烧等活动[1]。由于铅在土壤中的停留时间长，易通过水圈、大气层影响生物圈，进而通过食物链影响人类的健康，因此，土壤中的铅污染应引起人们的重视[2]。
　　为了保护环境，避免人类健康受损害，土壤重金属污染的修復是国内外学者研究的热点。微生物修复因为费用低、效果好、不会或很少造成二次污染，逐渐取代了传统的物理修复和化学修复[3]。笔者拟以从某工厂处理水剩余污泥中筛选出的铅耐性菌株为材料，应用16S rDNA基因测序，结合形态观察和生理生化特性试验确定其类别，并探索对其适宜生长环境条件，利用扫描电镜对其铅吸附机理进行初步分析，以明确其对重金属铅的吸附机制，为后期重金属铅污染生物修复的实际应用提供理论依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料及培养基
　　菌株筛选土壤样品采自某工厂处理水剩余污泥。
　　基础牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L，加蒸馏水至1 000 mL;调节pH值至7.0～7.2;1×105 Pa灭菌20 min。如配置固体培养基添加20 g琼脂。
　　选择培养基：称取16 g Pb（NO3）2溶于超纯水，用容量瓶定容至100 mL，配置成浓度为100 g/L的铅母液。将配置好的母液加入基础培养基中，调节至相应浓度。
　　1.2 菌株的分离与筛选
　　称取10 g污泥样品于90 mL无菌水中，30℃、150 r/min摇床振荡24～48 h，静置后取上清液涂布在铅浓度为200 mg/L的初筛培养基上，30℃培养24 h。在平板上挑选长势较好的菌落进行划线分离纯化，将初筛得到的菌株分别接种到不同铅浓度培养基中进行培养，逐步提高培养基中的铅浓度（50、100、150… mg/L 逐渐递增）进行复筛[4]，最终筛选出一株抗性最好的菌株，命名为J2，用于后续试验。 　　1.3 菌株的鉴定
　　1.3.1 菌株形态学观察和生理生化特征鉴定 在基础培养基中观察菌落的形态、边缘和颜色等，用革兰氏染色法染色，在光学显微镜下观察菌株形态。通过糖醇发酵、甲基红（M.R）、乙酰甲基甲醇（V.P）、明胶液化、过氧化氢酶、纤维素分解、乙醇氧化、淀粉水解、七叶灵水解、尿素水解等试验，研究筛选菌株的生理生化特征[5-7]。
　　1.3.2 菌株16S rDNA的序列分析 采用16S rDNA序列测定法，委托青岛派森诺基因生物科技有限公司进行16S rDNA测序。将所得序列进行相似性比对分析，利用MEGA-X软件生成系统发育树[5]。
　　1.4 菌株生长曲线的测定
　　挑取筛选菌株单菌落，30℃、150 r/min于液体培养基中培养24 h，用无菌移液管分别吸取1 mL菌液接种至50 mL液体培养基中，并在相同条件下将菌液接种至含铅200 mg/L的培养基中（设空白对照），30℃、150 r/min摇床培养，在96 h培养周期里，每2 h取样1次。在8 000 r/min条件下离心5 min，沉淀的菌体用生理盐水洗涤3次后，重新悬浮于生理盐水中，在可见分光光度计下测定660 nm处菌体的OD值;上清液经稀释、过滤后用电感耦合等离子光谱仪测定铅浓度，以不接入菌体的空白含铅培养基为对照组，计算铅去除率[8]。
　　铅去除率=×100%
　　1.5 不同因素对耐铅菌株生长量和对Pb2+去除能力的研究
　　以溶液pH值、接种量和吸附温度为单因素[9]，考察菌株在各条件下的生长情况和对铅的去除效果。首先设定溶液pH值为5、6、7、8、9，铅浓度为200 mg/L，接种量为5%，30℃、150 r/min摇床培养24 h，按照上述方法检测菌体生长情况和对铅的去除效果。然后依次确定接种量（2%、3%、5%、8%、10%）和培养温度（20、25、30、35℃）的最佳值。
　　1.6 扫描电镜分析
　　收集吸附铅前后的菌样，样品经过固定、脱水、真空冷冻干燥等步骤，制备超薄菌株切片样品，置扫描电镜下观察，对筛选菌株吸附铅的机理进行初步分析[10]。
　　2 结果与分析
　　2.1 耐铅菌株的筛选与鉴定
　　在不断增加培养基的铅浓度后，最终经过分离与筛选，得到了能在浓度为800 mg/L的含铅培养基中生长的菌株，将其命名为J2。
　　2.1.1 菌株形态特征 形态学观察发现，J2菌株呈黄色，菌株为圆形，表面隆起，有极生鞭毛，其菌落边缘整齐、有粘性。
　　2.1.2 菌株生理生化结果 对J2菌株进行革兰氏染色，结果表明其为革兰氏阴性菌。J2菌株生理生化试验结果如表1所示，J2菌株可利用葡萄糖、乳糖和蔗糖进行发酵，M.R和V.P试验均呈阳性，可分解明胶、七叶灵和淀粉，不能分解纤维素和尿素，能分泌过氧化氢酶，不能氧化乙醇。
　　2.1.3 基于16S rDNA基因序列的菌株分子生物学鉴定 对J2菌株的16S rDNA进行扩增，用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对，初步鉴定J2菌株为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.），系统发育树结果见图1。
　　2.2 菌株的生长曲线测定
　　由图2可知，J2菌株对铅的吸附率随着时间的延长、菌体数目的增加呈上升趋势。接种0～5 h菌株处于生长调整期，5～36 h处于对数生长期，36 h后菌株开始进入稳定期，60 h后进入衰亡期。
　　J2菌株去除培养基中重金属铅的过程，主要表现为2个阶段。第一个阶段是在对数生长期和稳定期，去除率随菌体数量的增加呈上升趋势。当菌体生长进入稳定期末期和衰亡期时，铅去除率变化进入第二阶段，经过平台期后，继续持续增长。第一阶段，J2菌株细胞表面的化学基团可以吸附重金属铅。这个过程不需要依靠微生物自身代谢，发生过程很迅速，因此表现为菌体数量和去除率变化保持同步。在第二阶段菌体数量开始下降时，铅去除率依然在上升，表明J2菌株还存在着对铅的累积或转化作用。这个过程J2菌株对铅的去除表现为主动吸附，即将重金属由表面转移到内部的过程，该过程需要菌株细胞自身代谢产生的能量，因此这一过程需要一定时间[11]。
　　2.3 不同因素对耐铅菌株生长量和对Pb 去除能力的研究结果
　　2.3.1 pH值 不同微生物对pH值的要求不同，由图3可知，当pH值为9时，J2菌株生长情况最好且对铅去除率最高。这可能是因为，随着pH值的增加，菌体表面更多的负电官能团暴露于液体中，从而有更多的吸附位點吸附重金属离子铅。
　　2.3.2 接种量 由图4可知，菌株对铅的去除率随着接种量的增加而增加，当接种量为5%，其去除率和菌株数目都达到最高。随着接种量的增加，菌体表面对铅的吸附位点也增加，因此铅去除率提高;当培养
　　基一定时，随着接种量继续增大，培养基无法提供足够的碳源和其他养分，导致耐铅菌株数量减少。因此当接种量大于5%时，菌体对铅去除率和菌体数目均呈下降趋势。
　　2.3.3 温 度 由图5可知，在20～30℃范围内，J2菌
　　株的生长情况和对铅的去除率随着温度的升高而上升，当温度为30℃时，J2菌株数目最多，铅去除率最高。因为温度的升高为菌株吸附铅的过程提供了能量，故提高了菌株的铅去除率。但当温度超过30℃时，过高的温度可能影响了菌体的正常代谢，对菌体细胞表面的官能团和重金属的结合产生不利影响，因此J2菌株的生长量和铅去除率都呈下降趋势。
　　2.4 J2菌株扫描电镜和能谱结果分析
　　为了研究J2菌株对铅的去除机理，采用扫描电镜对吸附铅前后的菌体进行观察，结果如图6所示。从图6A可以看出，J2菌株的菌体细胞呈直杆状，形态饱满、轮廓清晰，细胞表面平整，无粘附物。相对于空白组，吸附了铅的菌体细胞表面粗糙，细胞形态发生干瘪或扭曲变形，并且出现不规则聚集现象（图6B）。这表明J2菌株存在着对铅的表面吸附作用，所以细胞表面变粗糙。结合2.2中生长曲线的研究结果，初步推测J2菌株对铅的去除机理包括表面吸附和胞内累积或转化。 　　3 结 论
　　从某工厂处理水剩余污泥中分离筛选出一株耐铅菌株J2，通过16S rDNA初步鉴定其为寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）。对J2菌株的耐受性和吸附能力进行检测，发现J2菌株对重金属铅的最大耐受浓度为800 mg/L，在生长96 h之后對铅的去除率可达76%。
　　研究不同pH值、接种量和温度对J2菌株生长的影响，结果表明，J2菌株去除铅的最佳pH值为9、最适接种量为5%、最适温度为30℃。
　　根据J2菌株吸附铅前后扫描电镜结果，结合生长曲线分析，认为J2菌株对铅的去除机理包括前期表面吸附和后期胞内累积或转化2种形式。
　　试验筛选的J2菌株对铅的去除能力高，可丰富重金属污染土壤微生物修复的生物资源，用于低质量浓度铅污染土壤的生物修复。
　　参考文献：
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　　（责任编辑：张焕裕）
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