中草药水浸提液对5种植物病原真菌的影响

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　　摘要 [目的] 探索对植物病原真菌具有抑菌活性的中草药。[方法] 在室内采用菌丝生长速率法测定黄连、黄芩和大黄水浸提液单剂及其复合剂不同浓度对5种植物病原真菌菌丝的抑制作用。[结果] 60%黄连、黄芩和大黄水浸提液对辣椒疫霉病菌和西瓜蔓枯病菌抑制率分别达97.7%和88.2%、87.3%和84.3%、73.5%和84.5%，抑制效果均较好;大黄对葡萄灰霉病菌的抑制效果优于黄连和黄芩，抑制率可达59.0%;黄连对葡萄炭疽病菌和玉米茎基腐病菌的抑制效果优于黄芩和大黄;除葡萄灰霉病菌外，不同浓度的水浸提液复合剂对其他4种病原真菌的抑制率均高于大黄，低于黄连，总体抑制效果及趋势与黄芩相近。[结论] 黄连水浸提液抑菌范围最广、效果最好，可进一步为新型天然杀菌剂的研制和开发提供新途径。
　　关键词 黄连;黄芩;大黄;水浸提液;抑菌率
　　中图分类号 S 482.2文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）17-0172-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.17.044
　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
　　Effect of Chinese Herbal Medicine Water Extract on Five Plant Pathogenic Fungi
　　JIANG Jing jing1，2， PENG Pei rang3， SU Feng feng3 et al
　　（1.Institue of Plant Protection，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou，.Gansu730070;2.Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Tianshui，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Tianshui， Gansu 741000;3.College of Life Sciences， Northwest Normal University， Lanzhou， Gansu 730070）
　　Abstract [Objective] To explore Chinese herbal medicines that have antifungal activity against phytopathogenic fungi.[Method] The mycelial growth rate method was used to determine the single agent and compound of Coptis chinensis，Scutellaria and Rhubarb water extracts in different concentrations against the five plant pathogenic fungal mycelia.[Result]60% of Coptis chinensis，Scutellaria and Rhubarb water extracts had inhibition rates of 97.7% and 88.2%，87.3% and 84.3%，73.5% and 84.5%，respectively，against Phytophthora capsici and Mycospharella melonis，had the better inhibitory effects;Rhubarb had better inhibitory effects on Botrytis cinerea than Coptis chinensis and Scutellaria，with an inhibition rate of 59.0%;Coptis chinensis had better effects on Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum than Scutellaria and Rhubarb;except for Botrytis cinerea，the inhibitory rates of different concentrations of water extract solution complexes on the other four pathogenic fungi were higher than Rhubarb and lower than Coptis chinensis，and the overall inhibition effect and trend were similar to that of Scutellaria.[Conclusion]It indicated that Coptis chinensis water extract had the wide range of antifungal and had the best effect，which can further provide a new way for the research and development of new natural fungicides.
　　Key words Coptis chinensis;Scutellaria;Rhubarb;Water extraction;Inhibition rate
　　植物病原真菌對植物造成严重的危害，如引起葡萄灰霉病的灰葡萄孢（Botrytis cinerea ），其寄主范围极其广泛，能侵染200多种农作物，并在多种重要作物上造成重大经济损失[1];引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌（Phytophthora capsic），常引起病害的流行发生，导致植株成片死亡，损失严重，严重时病株率达80%以上[2]。由于大多数病原真菌变异能力强，致病力分化明显，传统防治方法主要依靠化学农药来防治病害，大量化学农药的使用容易诱导病菌产生抗药性，一方面导致化学农药的防治效果降低，加大了防治难度，另一方面严重污染生态环境，开发新型环保的化学农药替代品势在必行。 　　生物防治是目前国内外防治植物病害的研究热点，主要包括拮抗菌（真菌、细菌）和天然产物防治。大多数生防菌株由于自身的局限性和环境条件等因素的影响，只有少量生防资源可实际应用且防治效果不理想，稳定性较差，植物源农药研究的兴起为植物病害的生物防治开辟了一条新的途径[3]。我国中草药资源丰富，品种繁多，许多中草药含抑菌活性物质，是防治有害微生物的天然宝库[4]。如黄连、大蒜和黄芩对菊果胶杆菌具有显著抑菌效果[5];白花蛇舌草、金钱草、丹参和甘草配伍对细菌和霉菌抑菌效果最好[6];连翘、大黄水提物对大斑病凸脐蠕孢菌具有明显的抑制效果[7];黄连对柑橘采后3种病原菌具有较强的抑制作用和防治潜力，综合抑菌率达98.37%[8]。
　　笔者选取平时多见且医用有消炎作用的毛茛科黄连（Coptis chinensis）、唇形科黄芩（Scutellaria）和廖科大黄（Rhubarb），制备3种中草药的不同浓度水浸提液以及不同浓度复合剂，以5种不同的植物病原真菌（辣椒疫霉病菌、西瓜蔓枯病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌和玉米茎基腐病菌）为测试对象，研究3种中草药的农用抑菌活性，旨在为新型生物农药开发提供依据，为中草药利用提供新思路。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料 供试中草药：黄连、黄芩，大黄均为市售。
　　供试菌株：葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、西瓜蔓枯病菌（Mycospharella melonis）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、玉米茎基腐病菌（Fusarium oxysporum），均由甘肃省农业科学院植物保护研究所经济作物病害研究室分离保存。
　　供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，即马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL，pH自然。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 中草药水浸提液的制备与稀释。参考徐国钧等[9]的方法，取中草药100 g在1 000 mL蒸馏水中浸泡20 min，然后在电磁炉上加热至煮沸，转小火煮30 min（温度160 ℃左右），用纱布过滤出滤液。滤渣再加水500 mL，同样方法煎煮约30 min后过滤，取2次滤液混合，用蒸馏水定容至1 000 mL（即中草药水浸提液）。
　　取浸提液50、100、150、250及300 mL，用蒸馏水分别定容至500 mL，即制成浓度为10%、20%、30%、50%及60%的浸提液，密封置冰箱中冷藏备用。
　　将几种中草药水浸提原液按体积等量（1∶1∶1）混合后，制成中草药水浸提液复合剂，分别用蒸馏水稀释成浓度为10%合剂、30%合剂、60%合剂，密封置冰箱中冷藏备用。
　　1.2.2 含药培养基的制备。用中草药水浸提液代替PDA培养基中等量的水，配制含药PDA培养基。
　　1.2.3 含药培养基抑菌效果的测定。将供试菌株在PDA培养基活化培养3 d后，在接近菌落边缘生长一致的地方打取直径5 mm的菌饼，单个菌饼菌丝面朝下紧贴含药PDA平板中央接入，以PDA为空白对照，每处理重复3次，置于26 ℃条件下培养6 d，第7天采用十字交叉法测量菌落直径。依据记录菌落直径，计算各处理浓度对所测真菌菌丝的生长抑制率。菌丝生长抑制率=（D0-Dt）/D0×100%，其中，D0为空白对照的菌落直径增长量，Dt 为药剂处理的菌落直径增长量，菌落直径增长量=测得的菌落直径-菌饼的直径。
　　1.3 数据分析 利用SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析，应用Duncan氏新复极差法进行差异显著检验。
　　2 结果与分析
　　2.1 不同浓度的黄连水浸提液对5种病原菌的抑制效果
　　黄连水浸提液对供试的5种病原菌均具有较好的抑制作用（表1），其中对辣椒疫霉病菌和西瓜蔓枯病菌效果最好，当浸提液浓度仅为10%时抑制率达82.5%和75.9%，且随着浓度升高抑制率也升高;60%的黄连浸提液对葡萄炭疽病菌和玉米茎基腐病菌也具有一定的抑制效果，抑菌率达50%以上;黄连水浸提液对葡萄灰霉病菌抑菌效果最差，且当浓度为50%时抑菌率不再随着浓度的升高而升高。
　　2.2 不同浓度的黄芩水浸提液对5种病原菌的抑制效果
　　10%的黄芩水提液对辣椒疫霉和西瓜蔓枯菌抑制率均超过50%，且随着黄芩浓度的提高，抑制率也增强，可达873%;对葡萄灰霉病菌抑制效果较弱，当浓度达60%时抑制率达44.3%;对葡萄炭疽病菌和玉米茎基腐病菌的抑制效果最弱，且随着黄芩水提液浓度的升高，并没有显著提高其抑菌效果，其中对葡萄炭疽病菌的抑制效果表现出高浓度反而降低（表2）。
　　2.3 不同浓度的大黄水浸提液对5种病原菌的抑制效果
　　大黄水提液对辣椒疫霉和西瓜蔓枯抑制效果最好，随着大黄浓度的提高抑制率也增强，当浸提液浓度为60%时抑制率分别为73.5%和84.0%;其次为葡萄灰霉病菌，当浸提液浓度为60%时抑制率达59.0%;对葡萄炭疽病菌和玉米茎基腐病菌的抑制效果最弱（表3）。
　　2.4 不同濃度的水浸提液复合剂对菌株的抑菌效果
　　将3种中草药水浸提液按体积等量（1∶1∶1）混合后，制成中草药水浸提液复合剂，用蒸馏水稀释成10%合剂、30%合剂、60%合剂。由图1可知，除灰葡萄孢外，不同浓度的3种水浸提液复合剂对其他4种植物病原真菌菌丝生长抑制率均高于不同浓度的大黄水浸提液，低于不同浓度的黄连水浸提液，总体抑制效果及趋势与黄芩水浸提液相近;水浸提液复合剂对葡萄灰霉的抑制效果最差，弱于3种中草药水浸提液单独作用。表明将3种中草药混合后，抑菌成分均存在，没有显著提高药效或者减弱药效。 　　3 结论与讨论
　　中草药作为天然的抑菌药物，其抗菌、低毒、无副作用、无残留等优点在现代预防和抗真菌细菌感染方面发挥了积极作用。研究证实在对人体致病菌有抑制作用的常见中草药中，有的对植物病菌有一定的抑菌效果。周勇等[5]研究发现黄连对菊果胶杆菌抑菌效果最优，黄芩次之;李家洲等[10]研究发现黄连水提液对尖孢镰孢菌具有较好的抗菌效果，与该研究结果基本一致;王艳红等[11]研究发现中药黄连对番茄早疫病菌的抑菌效果最好，大黄次之，抑制率达93.9%。该试验中黄连对5种病原真菌均表现出较好的抑制效果，对辣椒疫霉病菌和西瓜蔓枯病菌的抑制率分别达97.7%和88.2%，对葡萄灰霉病的抑制效果最差，但浓度为60%时抑制率也能达44.5%，表明黄连水浸提液不但抗菌谱广泛，还具有良好地抑制真菌菌丝生长的作用，为后期研发绿色农药防治疫霉病、西瓜蔓枯病、炭疽病、枯萎病等提供新思路。杨金凤等[12]研究发现黄芩对桃褐腐病菌抑菌率达80%以上，对供试的16种植物病原真菌也有不同的抑制效果，抑菌谱较广;金丽琼等[7]研究发现大黄水提物对大斑病凸脐蠕孢菌具有良好的抑制效果。该研究中黄芩和大黄水浸提液浓度为60%对辣椒疫霉、西瓜蔓枯、葡萄灰霉病菌也表现出较好的抑制效果，进一步扩大了中草药的抗菌谱，为中草药的开发利用提供了参考。
　　种类繁多的植物次生代谢产物虽然能够为植物源抗菌研究提供廣阔空间，但其成分复杂、分离困难、抑菌机制还不明确，使得植物源抑菌剂的应用受到很大的限制[13]。目前主要对已经明确化合物成分的植物活性物质进行单独或按照一定比例进行复配后的抑菌机理评价及抑菌效果研究。配伍后的中药并不是某种单味化学成分的相加，而是某些化学成分溶出率的改变、水解、氧化、挥发、螯合、沉淀等化学和物理变化，使得原有的某些化学成分消失或产生新的化合物从而能够避免某种药单独作用药效不够又能够避免某种药作用损害造成损伤的困境即出现减毒、增效的效果[14]。该研究中黄连、黄芩和大黄3种中草药复配的合剂，药效并未出现明显的减毒或者增效的效果，抑菌率总体趋势为黄连>复合剂≥黄芩>大黄，这可能与中草药的成分及中药配伍的复杂性有关。目前中草药及配伍大部分研究处于筛选和初步探索阶段，仍存在许多问题有待解决。未来植物源抑菌方面应大力发展成分分离技术，有效利用各成分，将抑菌研究与其他研究领域相结合，做到资源高效利用，从而降低生物农药应用成本，更好地应用于农业生产。
　　中草药活性成分复杂，提取方法和所用溶剂不同，提取
　　物中的化学成分也不同。该研究采用中草药水浸提液进行试验，避免了提取过程中有机试剂对环境的污染，降低了生产成本，具有生产简便、经济、无污染等特点。但仅在室内测定了3种中草药水浸提液的抑菌活性，试验结果尚需在温室盆栽及田间进一步验证。
　　参考文献
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