γ-聚谷氨酸对6种植物病原真菌的室内毒力测定

来源:用户上传      作者:汪少丽 王英姿 王洪涛 刘保友 史大臣

　　摘要： 用不同浓度的γ-聚谷氨酸对6种植物病原菌（葡萄白腐病菌、樱桃茎腐病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、苹果轮纹病菌）的抑菌效果和毒力进行测定。结果表明，在16.67 g/L质量浓度下，γ-聚谷氨酸对葡萄白腐病菌的相对抑制率最高，为73.10%，其次是对樱桃茎腐病菌的相对抑制率为63.09%，而对小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、苹果轮纹病菌的相对抑制率则较低，分别为39.18%、33.16%、32.64%、24.54%。毒力测定发现，γ- 聚谷氨酸对葡萄白腐病菌的毒力最强，EC50为12.803 0 g/L，其次是对于樱桃茎腐病菌、花生褐斑病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌的毒力，其EC50分别为13.624 1、18.336 0、18.773 5、23.600 7 g/L，对苹果轮纹病菌的毒力最弱，其EC50为34.490 3 g/L。
　　关键词： γ-聚谷氨酸;植物病原真菌;菌丝生长法;相对抑制率;室内毒力测定
　　中图分类号： S432.4+4  文献标志码： A
　　文章编号：1002-1302（2020）05-0110-03
　　  γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，简称γ-PGA）是一类由芽孢杆菌发酵产生的胞外多肽，最早于1937年被发现，存在于炭疽芽孢杆菌的外荚膜中[1]，1942年Bovarnick发现，枯草芽孢杆菌也能够产生γ-聚谷氨酸[2]。γ-聚谷氨酸作为一种新型可生物降解的水溶性高分子材料[3]，已被广泛应用于农业、医药、化工、污水处理等领域[4-7]，是一种具有极大开发价值和应用前景的新型多功能生物制品。
　　近年来，γ-聚谷氨酸及其衍生物在农业中得到越来越多的应用，尤其在土壤和肥料等方面发展迅速。如张新民等研究发现，γ-聚谷氨酸是一种优良的土壤保水劑[8];汪家铭发现，γ-聚谷氨酸不仅能够提高肥料的利用率，还能够延长肥料在土壤中的释放周期[9]。但目前关于γ-聚谷氨酸对农作物病原真菌的作用研究却鲜有报道。本研究选择6种主要植物病原真菌（葡萄白腐病菌、樱桃茎腐病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、苹果轮纹病菌）进行γ-聚谷氨酸的抑菌试验，分别测定γ-聚谷氨酸对这6种病原真菌的毒力，旨在为进一步研究γ-聚谷氨酸抑制病原真菌机制提供理论基础，同时，也为γ-聚谷氨酸应用于农作物病原真菌的田间防治提供研究基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 供试药剂
　　γ-聚谷氨酸由烟台市佳益有机肥料有限公司提供，由芽孢杆菌发酵产生。
　　1.1.2 供试菌种
　　供试菌种主要有葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、樱桃茎腐病菌（Phytophthora nicotianae）、小麦纹枯病菌（Rhizotonia cerealis）、黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea），均由山东省烟台市农业科学研究院提供，经活化培养后保存在4 ℃冰箱，所用培养基为常规PDA培养基。
　　1.2 试验方法
　　供试药剂对病原菌的毒力测定采用菌丝生长速率法。将供试药剂γ-聚谷氨酸加入到融化的PDA培养基中，配制成5个不同质量浓度（6.67、8.30、10.00、12.50、16.67 g/L）的带药平板培养基，以无菌水作空白对照。在活化好的6种植物病原菌菌株的菌落边缘用灭菌的打孔器打取直径为 0.5 cm 的菌丝块，分别移到带药平板培养基上，每处理设置5个重复。在25 ℃恒温培养箱中培养 5～7 d 后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌落直径平均值和菌丝生长抑制率。
　　抑制率=（对照组菌落直径-0.5 cm）-（含药组菌落直径-0.5 cm） 对照组菌落直径-0.5 cm×100%。
　　1.3 数据分析
　　将菌丝生长抑制率换算成机率值（y），药剂浓度换算成质量浓度对数（x），按质量浓度对数与机率值回归法求得线性回归方程：y=a+bx，并以回归方程计算γ-聚谷氨酸对6种植物病原菌的抑制中浓度（EC50）、机率值与质量浓度对数之间回归的相关系数（r），数据利用Excel、DPS分析软件进行方差分析和差异显著性分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 γ-聚谷氨酸对6种植物病原菌的抑制率
　　γ-聚谷氨酸的5个试验质量浓度对葡萄白腐病菌、樱桃茎腐病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、苹果轮纹病菌的菌丝生长均具有不同的抑制作用，菌落扩展直径均小于对照。其中，γ-聚谷氨酸的质量浓度范围为6.67～16.67 g/L时对葡萄白腐病菌的抑制作用最强，菌丝扩展直径范围为 1.77～5.15 cm，抑制率范围为21.57%～73.10%;对樱桃茎腐病菌的抑制作用次之，其菌丝扩展直径范围为2.70～7.08 cm，抑制率范围为3.20%～63.09%，对于小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、苹果轮纹病菌的抑制作用则依次减弱，抑制率范围分别为5.24%～39.18%、9.55%～33.16%、0.40%～32.64%、2.89%～24.54%（表1）。
　　2.2 γ-聚谷氨酸对不同病原菌的毒力测定
　　2.2.1 γ-聚谷氨酸对不同植物病原菌的抑制率中浓度比较
　　由表2可知，γ-聚谷氨酸对葡萄白腐病菌及樱桃茎腐病菌的EC50较小，分别为 12.803 0、13.624 1 g/L，表现出较强的毒力，对花生褐斑病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌的毒力次之，其EC50分别为18.336 0、18.773 5、23.600 7 g/L，而对苹果轮纹病菌的EC50最大，为34.490 3 g/L，表现出弱毒力。 　　2.2.2 γ-聚谷氨酸对6种植物病原菌的敏感性比较
　　杀菌剂室内毒力测定中EC50越小、斜率越大说明病原菌对药剂的反应灵敏度越高，即随着药剂浓度的增加，抑制率明显增大。但有研究表明，回归方程的斜率与病原菌对杀菌劑的敏感性成正比[10-11]。本研究中γ-聚谷氨酸对葡萄白腐病菌、樱桃茎腐病菌、花生褐斑病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌、苹果轮纹病菌的毒力回归方程的斜率分别为3.609 7、6.093 6、6.075 2、3.282 2、2.368、2.859 9（图1）。由此可见，供试药剂回归方程的斜率与病原菌对杀菌剂的敏感性非正相关，其原因还须后期田间试验结果的验证。
　　3 结论与讨论
　　γ-聚谷氨酸作为一种芽孢杆菌代谢产物，不仅在农业肥料应用中具有良好效果，在杀虫剂、除草剂、驱虫剂等农药中适量添加也能够延长这些药物在作物表面的停留时间，使作物叶片表面的农药不容易因为干燥、下雨而流失，从而提高农药作用效果[12]。但目前关于γ-聚谷氨酸对于植物病原真菌直接的生长抑制作用研究鲜有报道。王启军曾证实由枯草芽孢杆菌发酵产生的γ-聚谷氨酸对于玉米小斑病菌生长并无抑制效果[13]。刘俊研究发现，因为γ-聚谷氨酸具有很强的黏性，可以吸附大量的阳离子，从而增强生防菌菌体之间的聚集和吸附能力，增加植物的抗病性，但这些报道并未证实γ-聚谷氨酸对于病原真菌的菌丝生长具有抑制作用[14]。而本研究结果表明，γ-聚谷氨酸对6种不同植物病原真菌的菌丝生长具有不同的抑制作用，且对于不同植物病原真菌亦具有不同的毒力，其毒力由大到小排序为葡萄白腐病菌>樱桃茎腐病菌>花生褐斑病菌>小麦纹枯病菌>黄瓜灰霉病菌>苹果轮纹病菌，其中以γ-聚谷氨酸对葡萄白腐病菌的菌丝生长抑制作用最强，EC50为 12.803 0 g/L。但γ-聚谷氨酸对于不同病原真菌菌丝生长的具体是通过形成高分子膜包被菌丝从而抑制菌丝的延展还是通过对菌体细胞的直接破坏毒杀作用而完成的[15]，目前仍不清楚，这也是后期要进行深入探索研究的。
　　葡萄白腐病菌、樱桃茎腐病菌、小麦纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、苹果轮纹病菌是农业生产中的重要病害，对农作物产量和品质影响极大。目前对上述病害的防治仍以化学防治为主，但由于用药不科学，多年持续使用单一药剂，造成病原菌对一些杀菌剂已产生了不同程度的抗药性[16-17]。因此，一些新型绿色生物农药的研制对于防治上述病害迫在眉睫，γ-聚谷氨酸无污染、无残留、无抗药性，其对于植物病虫害防治的研究已成为近年来的研究热点，本研究结果为从芽孢杆菌发酵产物中提取γ-聚谷氨酸并将其作为新型农药的应用提供了研究基础。
　　参考文献：
　　[1]Ivanovics G，Bruckner V. Chemische and immunologische studien uber mechanimus der milzbrandinfektion and immunitat;die chemische strukt under kapdelsubstanz des milzbrandbasillus undder serologisch identischen spezifischen substanzdes Bacillus mesentericus[J]. Immunitatsforsch，1937，90：304-310.
　　[2]Bovarnick M. The formation of extracellular d-glutamic acid polypeptide by Bacillus subtilis[J]. Journal of Biological Chemistry，1942，145（2）：415-424.
　　[3]游庆红，张新民，陈国广，等. γ-聚谷氨酸的生物合成及应用[J]. 现代化工，2002，22（12）：56-59.
　　[4]吴学超，曹新江，冀志霞，等. 聚γ-谷氨酸高产菌的选育与培养基优化[J]. 微生物学通报，2008，35（10）：1527-1531.
　　[5]Oppermann-Sanio F B，Steinbuchel A. Occurrence，functions and biosynthesis of polyamides in microorganisms and biotechnological production[J]. Naturwissenschaften，2002，89（1）：11-22.
　　[6]Schallmey M，Singh A，Ward O P. Developments in the use of Bacillus species for industrial production[J]. Can J Microbiol，2004，50（1）：1-17.
　　[7]Shih I L，Van Y T. The production of poly-（γ- glutamic acid） from microorganisms and its various applications[J]. Bioresour Technol，2001，79（3）：207-225.
　　[8]张新民，姚克敏，徐 虹. 新型高效吸水材料（γ-PGA）的农业应用研究初报[J]. 南京气象学院学报，2004，27（2）：224-229.
　　[9]汪家铭. 聚γ-谷氨酸增效复合肥的发展与应用[J]. 硫磷设计与粉体工程，2010（1）：20-24.
　　[10]范鸿雁，谢艺贤，张辉强. 几种杀菌剂对香蕉枯萎病菌的室内毒力测定[J]. 农药，2004，43（3）：142-143.
　　[11]胡秀荣，鹿连明，蒲占湑，等. 7种杀菌剂对柑橘炭疽病菌的室内毒力测定[J]. 中国农学通报，2010，26（11）：272-275.
　　[12]李晶博，李 丁，邓毛程，等. γ-聚谷氨酸的特性、生产及应用[J]. 化工进展，2008，27（11）：1789-1792，1799.
　　[13]王启军. 枯草芽孢杆菌B6-1产脂肽和聚-γ-谷氨酸及抗几种植物病原菌的研究[D]. 武汉：华中农业大学，2008：74-76.
　　[14]刘 俊. 解淀粉芽抱杆菌防治桃褐腐病菌的机制及其产生的 γ- 多聚谷氨酸在定殖中的作用[D]. 南京：南京农业大学，2010：92-93.
　　[15]李美芹. 壳聚糖抑制番茄叶霉病菌的活性与诱导抗性及其机理研究[D]. 青岛：中国海洋大学，2007：60-61.
　　[16]时春喜. 果树病害发生规律及抗药性研究进展[J]. 农药市场信息，2018，634（25）：6-11.
　　[17]姜莉莉，乔 康. 我国小麦纹枯病抗药性研究进展[J]. 农药研究与应用，2010，14（3）：11-14.
　　收 稿日期：2019-02-12
　　基金项目：山东省烟台市科技计划（编号：2017NC022）;山东省农业科学院农业科技创新工程（编号：CXGC2016B11）;山东省现代农业产业技术体系果品产业创新团队病虫防治与质量控制岗位专家专项（编号：SDAIT-06-11）。
　　作者简介：汪少丽（1989—），女，山东烟台人，博士，农艺师，主要从事植物病害防治及机理研究。Tel：（0535）6352015;E-mail：shaoliwang123@126.com。
　　通信作者：王英姿，研究员，硕士生导师，主要从事果树、蔬菜植物保护等研究。Tel：（0535）6352015;E-mail：ytnkyzbs@yt.shandong.cn。

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