AMEP蛋白在不同芽孢杆菌中的表达量及活性差异分析

来源:用户上传      作者:郭世伦 张斌斌 李惠洋 刘鸿雁 刘权

　　摘 要：AMEP蛋白是从枯草芽孢杆菌中分离鉴定的一种新型蛋白激发子，能够激发植物免疫，提高植物抗病性。经生物信息学分析发现，AMEP蛋白的编码基因在芽孢杆菌属的菌株中广泛分布，但各菌株AMEP蛋白的表达产量和活性还有待研究。该研究对实验室保藏的多株芽孢杆菌进行PCR扩增鉴定基因，筛选出含有AMEP编码基因的菌株;通过蛋白表达纯化和定量确定了各菌株AMEP蛋白的表达量;并通过过敏反应试验比较各菌株AMEP蛋白的功能活性，确定菌株BU396 产AMEP蛋白的表达量最高，且具有正常的功能活性，适合于作为今后AMEP蛋白的表达菌株。
　　关键词：蛋白质激发子;芽孢杆菌;蛋白产量;过敏反应;蛋白活性
　　中图分类号 Q936 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2020）20-0023-03
　　Analysis of Expression and Activity of AMEP Protein in Different Bacillus
　　GUO Shilun et al.
　　（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163000，China）
　　Abstract：AMEP protein is a new protein elicitor isolated and identified from Bacillus subtilis，which can stimulate plant immunity and promote plant disease resistance. Bioinformatics analysis showed that the coding gene of AMEP protein was widely distributed in Bacillus strains，but the expression level and activity of AMEP protein in individual strain remained to be studied. In this paper，the strains containing AMEP coding gene were identified by PCR amplification. Then the expression level of AMEP protein in each strain was determined by protein expression and purification. Finally，the activity of AMEP protein produced by each strain was determined by hypersensitive reaction assay. BU396 was screened out for both good expression level and high activity，which was suitable for the future application.
　　Key words：Protein elicitor;Bacillus sp.;Protein yield;Hypersensitive reaction;Protein activity
　　激發子是可以刺激植物产生防卫反应的一类物质[1]。根据来源的不同，激发子可以分为生物源激发子和非生物源2种[2]。蛋白质激发子是生物源激发子，一般为与植物互作的病原菌或生防菌分泌，可以诱导植物的防卫反应，同时部分激发子还可以调节植物生长代谢，促进植物生长[3]。
　　AMEP蛋白是从枯草芽孢杆菌BU412中发现的一种新型蛋白激发子，可以诱导植物产生过敏反应（Hypersensitive reaction，HR），并提高了植物的抗病性[4]。此外，研究还发现该蛋白具有对病原菌的拮抗作用和对有害昆虫的杀虫活性[5-6]。AMEP蛋白作为一种多功能的蛋白质激发子，可应用到生物防治领域，具有开发为蛋白质生物农药的潜质。
　　BLAST比对显示，AMEP蛋白的编码基因在芽孢杆菌属内广泛分布。经本实验室前期研究发现，AMEP蛋白在多种芽孢杆菌中均有表达，但其表达量与活性因菌株的不同存在较大差异。要进一步对AMEP蛋白进行研究和开发，筛选出能够高效表达高活性AMEP蛋白的菌株尤为关键。
　　为了得到AMEP蛋白产量与活性最佳的菌株，本研究通过分析AMEP蛋白的编码基因，设计通用性引物进行PCR扩增，筛选出含有AMEP蛋白基因的菌株。并对各菌株进行发酵培养，通过蛋白纯化和定量检测确定蛋白表达量，通过过敏反应试验检测蛋白活性。本研究旨在筛选得到AMEP蛋白产量与活性最佳的菌株，为该蛋白的开发应用奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 供试材料 本试验筛选所用芽孢杆菌菌株均为本实验室保藏。烟草植株为Nicotiana tabacum，培养42d后取叶片进行过敏反应试验。
　　1.2 PCR筛选阳性菌株 为了筛选得到含有AMEP蛋白编码基因的芽孢杆菌菌株，对本实验室保藏的多株芽孢杆菌进行了PCR检测分析。通过分析AMEP蛋白的编码基因，设计了通用性引物（正向引物F：CGCGGATCCTTGTTCGGACCAATTTTA;反向引物R：CCGCTCGAGTTAGCCAAGAATCATTTT），通过菌液PCR扩增，检验各菌株中是否含有AMEP蛋白的基因。PCR扩增采用50μL反应体系，包括：1μL细菌菌液，上下游引物各0.5μL，1.2μL 10μmol/L dNTPs，4μL 50mmol/L MgCl2，5μL 10×PCR buffer，0.3μL Taq DNA聚合酶。PCR反应的扩增程序为：95℃预变性5min;95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环，4℃∞。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有250bp的目的条带，判断菌株是否为含有AMEP基因的阳性菌株。 　　1.3 各菌株中AMEP的表达量检测
　　1.3.1 菌株培养 采用平板三线法在LB平板进行菌株培养，挑取单克隆接种至YME液体培养基，在28℃、175r条件下培养24h。
　　1.3.2 AMEP蛋白的纯化与定量（1）发酵液预处理：将培养24h的发酵液取出50mL装入离心管中，在4℃的条件下以11000g离心15min，得到上清液。使用0.22μM的滤膜进行过滤除杂后备用。（2）过柱：根据AMEP蛋白的理化性质使用Source 15Q 4.6/100PE阴离子交换柱对目标蛋白质进行分离纯化。使用低盐缓冲液（20mM的Tris-HCl，pH7.5）平衡柱体，上样平衡后，使用40%的高盐缓冲液（20mM的Tris-HCl，1M NaCl，pH7.5）进行洗脱，收集蛋白样品。使用分子截留体积为30kDa的超滤管对蛋白样品进行超滤，舍弃<30kDa的蛋白样品，收集截留的蛋白样品，即为纯化好的AMEP蛋白。（3）蛋白浓度测定：使用微量分光光度计Nanodrop对蛋白样品进行浓度测定。波长调整为280nm，每次滴样品之前使用低盐缓冲液调零，记录每次得到的数据，经过换算，得到各菌株AMEP蛋白的表达水平。
　　1.4 各菌株AMEP蛋白活性检测 通过过敏反应实验检验各阳性菌株表达AMEP蛋白的活性。首先将AMEP蛋白进行稀释，控制目标蛋白质浓度为0.5mg/mL，使用无针头的注射器将0.2mL样品量注射到烟草叶片背面，以低盐缓冲液作为对照组。将处理过的烟草叶片置于黑暗避光环境中，室温放置24h后取出观察，根据枯斑大小对蛋白活性进行评估[7]。
　　2 结果与分析
　　2.1 各芽孢杆菌菌株中AMEP蛋白编码基因 通过分析AMEP蛋白的编码基因，设计了通用性引物，通过菌液PCR扩增检测AMEP编码基因的分布。结果发现，在本实验室保藏的多株芽孢杆菌中，共有4株芽孢杆菌包含有AMEP基因（图1），依次为1、7、10、13泳道样品，对应的菌株编号分别为BU66、BU108、BU278和BU396。
　　2.2 各芽孢杆菌菌株AMEP蛋白表达量的差异 经过对AMEP蛋白的表达、纯化以及浓度测定，检测了各芽孢杆菌菌株（BU66、BU108、BU278、BU396和BU412）中AMEP蛋白表达量的差异，其结果如图2所示。由图2可知，5株菌中菌株BU396为AMEP蛋白产量最高的菌株，其产量可达到1.8mg/mL。其他4株菌株BU108、BU278、BU412和BU66的AMEP的蛋白产量分别为1.37mg/mL、1.73mg/mL、1.72mg/mL和1.12mg/mL。5株芽孢杆菌中，菌株BU66目标蛋白的产量最低仅为1.12mg/mL。菌株BU396的AMEP蛋白产量显著高于其他菌株，而BU66、BU108的AMEP蛋白产量则显著低于其他菌株。
　　2.3 各芽孢杆菌菌株AMEP蛋白活性的差异 将测定浓度的AMEP蛋白进行稀释，控制蛋白濃度为0.5mg/mL，以低盐溶液作为对照组CK。采取0.2mL样品量分3次注射于烟草叶片后，将烟草置于黑暗环境下24h后观察烟草叶片坏死枯斑的大小，结果如图3所示。由图3可知，在5株菌株中菌株BU66中AMEP蛋白活性最低，其他4株菌株蛋白激发子活性则大致基本相同。综合分析，可以确定BU396菌株的AMEP蛋白产量最高，且活性好，适合为今后AMEP蛋白的表达菌株。
　　3 讨论
　　本研究通过PCR基因扩增、蛋白质纯化和过敏反应等方法，最终从5株芽孢杆菌中成功筛选得到了AMEP蛋白产量和活性最佳的菌株BU396。在相同的培养条件下，菌株BU396分泌的AMEP蛋白量可达1.8mg/mL，显著高于其他4株菌株;在蛋白质激发子活性比较过程中，菌株BU396和菌株BU108、BU278和BU412蛋白质激发子的活性无明显差异。然而菌株BU66蛋白质激发子活性明显低于其他4株菌株。
　　激发子可引起植物的过敏反应（HR）。HR是植物在被病原菌侵染过程中的一种应激反应，其主要表现为被侵染部位的组织发生局部坏死以防止病原菌在植物体内进一步扩散[8-9]。根据激发子的特性，本实验通过烟草过敏反应发现不同芽孢杆菌菌株表达的AMEP蛋白的活性存在差异。由于不同菌株表达的AMEP蛋白均为同一编码基因经过转录所得，推测AMEP蛋白分子空间结构存在差异，从而造成了AMEP蛋白活性的差异。蛋白质分子从低级结构到高级结构的组装过程中，蛋白质的空间结构受到诸多因素的影响，如温度、pH值、折叠酶和分子伴侣等[10-12]。菌株BU66的AMEP蛋白活性明显低于其他4株菌株，推测菌株BU66中AMEP蛋白的折叠过程可能存在缺陷，导致AMEP蛋白不能形成正确空间结构。
　　在AMEP蛋白质表达的研究过程中，菌株间AMEP蛋白的表达量存在明显差异，这可能是由AMEP蛋白基因在不同芽孢杆菌中表达情况存在差异所导致的。根据基因表达的位置效应[13-14]，AMEP蛋白基因在芽孢杆菌基因组的位置可能存在差异，造成基因在转录水平上的差异，从而使得不同芽孢杆菌蛋白的表达量存在差异。BU66菌株的蛋白表达产量最低，且活性也差，导致不能作为备选菌株，而BU108菌株的蛋白活性虽好，但其表达量偏低，也不适合作为备选菌株。
　　综上所述，本试验成功筛选得到了1株适合用于AMEP蛋白表达的芽孢杆菌BU396，该菌株在AMEP蛋白质表达量以及活性方面较其他4株菌株具有明显优势。本试验结果为AMEP蛋白的高效优质表达和AMEP蛋白激发子在植物病害防治的实际应用提供了依据。
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　　（责编：张宏民）
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